NGS与qPCR
NGS与qPCR
了解关键差异以及新一代测序何时比qPCR更有效
NGS和qPCR之间的差异
在比较新一代测序（NGS）与定量PCR（qPCR）技术时，主要区别在于发现能力。虽然两者都具有高灵敏度和可靠的变异检出性能，但qPCR只能检测已知的序列。相反，NGS是一种不需要事先了解序列信息的无假设方法。NGS对新基因的探索能力更强，定量罕见变异和转录本的灵敏度更高。
NGS与qPCR技术在可扩展性和通量方面也有所不同。靶点数量较少时，qPCR是有效的，但是当靶点数量较多时，qPCR的工作流程将非常繁琐。NGS更适合于研究多个靶点或多个样本。一次NGS实验就能以单碱基的分辨率鉴定数千个目标区域的变异。
NGS与qPCR：详细比较
与qPCR相比，某些NGS方法可以：
- 检测已知和新的转录本
- 对单个序列read进行定量，生成绝对的表达值，而不仅仅是相对的表达值
- 检测基因表达的细微变化，低至10%
- 鉴定新的转录本、选择性剪接的异构体、剪接位点以及小RNA和非编码RNA物种
- 在单次检测中分析＞1000个目标区域
qPCR和靶向NGS比较
| qPCR qPCR可对特定位置的特定变异进行分析。 |
靶向NGS 靶向NGS可同时对数百至数千个基因进行测序。 |
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| 优势1-5 |
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| 挑战1-5 |
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* 探索能力为鉴定新型变异的能力。
† 突变分辨率是鉴定的突变的大小。NGS可以进行大的染色体重排到单核苷酸变异的鉴定。
很明显，在鉴定变异方面，命中和缺失基因关联研究是怎样的。这就像钓鱼一样。我们意识到，NGS能使我们同时对基因组中更多的区域进行研究。
RNA-Seq与qPCR相比的优势
虽然qPCR可用于定量几个基因的表达，但它只能检测已知的序列。而使用NGS进行RNA测序（RNA-Seq）可以同时检测已知的和新的转录本。由于RNA-Seq不需要预先设计探针，所以能够获得无偏向的数据集，允许进行无假设的实验设计。
RNA-Seq与qPCR相比的主要优势：
- 提高检测新型转录本的发现能力
- 提高检测罕见变异和低表达基因的灵敏度
- 通量更高，可同时对多个样本的多个基因进行测序
- 动态范围更广，可在无背景噪音或信号饱和的情况下定量分析基因表达
何时使用NGS与qPCR
NGS和qPCR之间的选择取决于多个因素，包括样本数量、目标区域中的序列总量、预算考虑因素和研究目标。当目标区域数量较低（≤20个目标）且研究目标仅限于筛查或鉴定已知变异时，qPCR通常是个不错的选择。
其他情况下则NGS更能满足您的需求。与传统的反复检测方法相比，靶向NGS可以同时对多个样本中的多个基因进行测序，节省时间和资源。NGS的探索能力也更强，支持新型变异的检测。
从qPCR转换到NGS
MiSeq系统让实验室能够更轻松、更经济地利用新一代测序的强大功能。测序完成后，Correlation Engine等工具可以将之前的qPCR数据与NGS数据进行比较。
制备
Illumina Stranded mRNA Prep
用于分析编码转录组的简单、可扩展、经济高效、快速的单日解决方案。
RNA Prep with Enrichment + 靶向panel
以极高的捕获效率和覆盖度均一性实现对大量靶基因的快速靶向检测。
测序
MiSeq基因测序仪
对于较小的panel：靶向重测序、宏基因组学、小型基因组测序、靶向基因表达图谱分析等。
NextSeq 1000和2000系统
对于更大的panel：靶向测序、RNA-Seq、单细胞方法、外显子组测序等。
桌面式测序仪
探索并比较桌面式测序仪，找到适合您研究需求的测序仪。
分析
DRAGEN RNA App
DRAGEN RNA应用程序对RNA转录本进行NGS二级分析。
Correlation Engine
Correlation Engine是一个交互式组学知识库，它将私人组学数据置于生物学环境中，并具有高度管理的公共数据。
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参考文献
- Ozsolak F， Milos PM。 RNA测序：进展、挑战和机遇。 Nat Rev Genet. 2011；12：87-98。
- Wang Z， Gerstein M， Snyder M. RNA-Seq：转录组学革命性工具。 Nat Rev Genet. 2009；10：57-63。
- Myllykangas S and Hanlee JP. 利用新一代技术对人类癌症基因组进行靶向深度重测序。Biotechnol Genet Eng Rev. 2010; 27: 135–158.
- Illumina. 通过基因表达和调控研究实现高影响力的发现。https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/gated/gene-expression-profiling-e-book-web.pdf. 2023年3月23日查阅。
- Illumina. 新一代测序与qPCR相比的优势。https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/ngs-vs-qpcr.html。2023年5月22日查阅。