利用基因组学解密自身免疫性疾病
研究人员正在使用WGS和WES鉴定与狼疮和其他自身免疫性疾病相关的变异。
利用基因组学解密自身免疫性疾病
简介
我们的免疫系统以一种看似神秘的方式运作。一方面，我们体内的免疫细胞会程序化地抵御外来入侵者。自相矛盾的是，一个人的免疫细胞也可能攻击正常细胞，将它们视为的不熟悉的外来物质，引起自身免疫性疾病。
Carola Vinuesa（医学博士）已从事免疫疾病研究16年，专注于自身免疫性疾病，例如狼疮。她利用桑格测序，发现了对免疫调节和耐受极为重要的基因家族：Roquin和它的旁系同源Roquin 2。1,2她和她在澳大利亚国立大学John Curtin医学研究院的研究团队，在参与控制自身免疫的两个特殊T细胞家族方面取得了重要的发现。这两种细胞是滤泡辅助性T（Tfh）细胞和滤泡调节性T（Tfr）细胞。3–5
现在，Vinuesa教授是John Curtin医学研究院免疫学和传染病系的主任。她也是个性化免疫学中心（CPI）的副主任，该中心旨在了解自身免疫的遗传原因，优化诊断，改善治疗。她的目标是利用新一代测序（NGS）等遗传工具，了解患者之间的遗传差异，根据个体基因组确定更有效、个性化的治疗。
iCommunity采访了Vinuesa教授，了解了她如何使用HiSeq X Ten和HiSeq 2500系统揭示狼疮（也称为全身性红斑狼疮，即SLE）和其他自身免疫性疾病背后的遗传学知识，以及她在支持科学领域性别平等方面所做的努力。
Carola Vinuesa（医学博士）是澳大利亚国立大学John Curtin医学研究院免疫学和传染病系的主任，澳大利亚堪培拉个性化免疫学中心的副主任。
问：是什么激发了您研究自身免疫性疾病的兴趣？
Carolyn Vinuesa（CV）：在我的研究生涯早期，我们的主要兴趣之一是了解控制机体产生的抗体质量的生发中心反应。一个最不为人知的问题是抗体生产过程中的质量控制如何失效，这引起了我的兴趣。
我在第一个博士后期间，建立了化学（N-乙基-N-亚硝基脲，即ENU）诱导小鼠突变的大规模筛选项目，鉴定造成狼疮样表型的基因，这让我发现了新的基因家族Roquin。这让我开始研究与自身免疫性疾病相关的通路，我们发现了一些有趣的现象，这些发现与目前尚无治愈性治疗方法的临床问题相关。但是，考虑到狼疮和其他自身免疫性疾病的巨大临床和通路异质性，很明显我们需要鉴定分子或遗传差异，根据缺陷通路对患者进行分层，以便找到有效的治疗方法。
问：在NGS之前，您使用了哪些细胞和分子生物学工具来鉴定与疾病相关的基因变异？
CV：我们用传统的定位技术鉴定了Roquin。我们将携带致病突变的小鼠与具有不同遗传背景的小鼠杂交，利用多态标记鉴定与疾病相关的区域。将间隔缩小到少于1 Mb基因组后，我们对单个外显子进行了桑格测序。我们在当时未知的基因Roquin中鉴定了一个突变。
为了将我们的发现转化到人类疾病中，我们在全澳大利亚许多临床医生的帮助下建立了APOSLE（澳大利亚SLE点突变）队列。首先，我们进行了候选基因测序，鉴定了Roquin和相关基因的突变。该技术的一个限制是对300多名受试者中各个基因的多个外显子进行测序需要花费大量的时间和精力。仅Roquin就有20个外显子。因此，我们无法对许多基因进行测序。
然后，我们利用高分辨率熔解分析（HRMA）鉴定了突变，无需对整个外显子进行测序。但是，我们仍然只能关注少数基因，所以这种方法不够全面。
我们开始利用人类全基因组SNP芯片研究拷贝数变异。这项技术让我们每轮可处理数十名患者，鉴定一些与狼疮相关的拷贝数变异，我们目前正在跟进这些变异。然而，这些技术都无法在大量基因中检测罕见突变。
“外显子组测序使我们能够在受试者中鉴定罕见的和新的基因变异，检测其致病能力。”
问：你们如何使用NGS研究狼疮？
CV：我们从2010年开始使用HiSeq 2500系统进行全外显子组测序（WES）。WES使我们能够在受试者中鉴定罕见的和新的基因变异，检测其致病能力。
我们对APOSLE队列受试者的外显子组和基因组进行了测序。我们关注极端或严重的表型，包括近亲病例、多重家族以及早期发病患者，丰富那些由一个或几个带来强烈影响的罕见基因变异造成的病例。虽然罕见变异也许只能解释少数病例，但它们对于理解疾病发病机理极为有用。
我们对家系或多重家族多个受影响的受试者的基因组进行了测序。我们通过内部开发的生物信息学流程和优先排序算法来处理测序结果，该算法可以缩小潜在致病候选基因的范围。然后我们使用CRISPR-Cas9将一个或多个假定的致病突变引入小鼠体内，观察这些小鼠是否产生了自身免疫。并不是所有的人类综合征都能在小鼠中重现，一些分子在小鼠和人类中的信号不同。但是，假如在人类的突变引入小鼠体内后，小鼠开始产生狼疮样症状，我们即可得出结论：受试者携带的突变导致了这种疾病。
问：HiSeq 2500系统在您的实验室中表现如何？
CV：我们与生物信息学同事Matt Field合作，开发了我们的测序流程，他认为HiSeq 2500系统的优点之一是它的灵活性。它提供了自定义的运行模式，当我们优先考虑覆盖度时，它能够最大限度的增加测序内容，而当我们优先考虑速度时，它能够最大限度的缩短运行时间。每对碱基对的测序成本也很低。HiSeq 2500系统具有灵活性、快速的周转时间和高通量能力，是探索人类疾病变异的完美平台。我们经常使用HiSeq 2500系统的外显子组数据，并且总是对测序的质量印象深刻。
“HiSeq 2500系统具有灵活性、快速的周转时间和高通量能力，是探索人类疾病变异的完美平台。”
问：全基因组测序（WGS）在您的研究中有什么价值？
CV：我们发现，WES的覆盖度不够好，偶尔会漏检一些突变。因此，我们决定进行WGS，即使在外显子区域，它也能提供更深、更均匀的覆盖度，减少假阴性。这是由捕获试剂盒的差异造成的。
问：为什么选择HiSeq X Ten系统进行WGS？
CV：使用HiSeq X Ten系统进行WGS比使用HiSeq 2500系统更经济实惠，更快速。通常情况下，我们每批会送出20–50个样本进行WGS，周转时间为3–6周。
我们实验室没有HiSeq X Ten系统。我们在上海仁济医院建立了中澳个性化免疫学中心（CACPI），所以一直将WGS样本发送到Macrogene，最近又有一些发送到了Novogene。在不久的将来，我们可能会将澳大利亚队列的WGS样本送到Garvan研究所。
“使用HiSeq X Ten系统进行WGS比使用HiSeq 2500系统更经济实惠，更快速。”
问：您如何分析变异？
CV：我们开发了自己的变异数据库，它目前有来自300名受试者的800多万个变异，其中包括患狼疮患者和其他自身免疫缺陷疾病的CPI患者。我们可以根据不同的标准，例如频率、损伤预测、受试者队列、遗传模式等，扫描并提取变异。通过纳入受试者的临床信息，我们的目标是增强该数据库的功能。
问：您的变异数据库中有800多万个变异，您怎样确定优先研究哪些变异？
CV：我们使用自己的优先排序工具确定要研究的变异。该工具是疾病特异性的，因此我们针对不同的免疫疾病类型有不同的标准。我们正在专门寻找罕见和损伤性变异，我们的流程提供了来自dbSNP和外显子组整合数据库（ExAC）数据集的频率。我们用三种功能注释工具（PolyPhen、SIFT和CADD*）对损伤进行评分。我们还根据多个不同标准和来源（包括GWAS全基因组关联分析数据）考虑了具有临床意义的变异，以及基因与免疫功能和疾病的相关性。我们开发的算法考虑了所有上述因素，并能将变异排序。我们的系统不是完美的，但我们鉴定了一些我们认为可能具有临床意义的变异。
问：您的狼疮和自身免疫性疾病研究的下一步计划是什么？
CV：关于狼疮，我们已经有几个病例，其中两个或更多的罕见变异似乎与疾病表现相关。我们希望使用可靠的工具来研究遗传上位效应的可能性。我们正在构建携带一个或多个突变的小鼠模型，以便单独或联合研究这些变异的功能意义。破译我们在受试者身上发现的突变如何引起蛋白或细胞功能的变化，对于理解疾病的发病机理至关重要。最终，它将允许我们进行更准确的诊断，开发更有效的靶向疗法。
我们使用了类似的方法研究其他免疫疾病。与一些复杂疾病相同，我们相信我们会找到自身免疫性疾病完整的变异谱：从共同效应较弱的常见变异的组合，到少数或单个具有强致病效应的罕见变异。
“狼疮的分子诊断将使我们能够为患者提供更有针对性的治疗。”
问：自身免疫性疾病的分子诊断能够实现什么？
CV：目前针对狼疮有很多诊断方法。但我们相信它不是仅仅一种疾病，而是由不同的基因或通路引起、临床表现类似的多种不同疾病。如果我们能根据某些有缺陷的分子通路将患者分类到亚诊断或亚组，那么我们也许就能确定可能有益的不同治疗方案。
目前，对于狼疮还没有特定的治疗方法。我们倾向于使用广谱免疫抑制剂（例如类固醇）来控制疾病。但是，我们有许多也许可以使用的免疫调节药物，包括许多单克隆抗体。但是，我们不明白为什么对于有些患者有疗效，而其他患者没有。如果我们未来能够理解狼疮和药物反应的分子基础，我们就能提供更有针对性的治疗。
例如，我们在一名患脑部狼疮的小女孩身上发现了一种罕见的TREX1纯合突变，它导致了放大的1型干扰素应答。6市场上有1型干扰素阻断剂，但不是每例狼疮都有这种特征。鉴定分子病因可以确定对特定病例亚组有效，而对其他病例无效的疗法。
问：您认为怎样才能实现个性化医疗？
CV：很明显，对于某些疾病，我们需要分子诊断来确定哪种类型的治疗最有效。对于复杂疾病，有人怀疑它是简单到否只需一个或一组特定的突变就能进行诊断。
我认为在医学院教授基因组学的临床应用对推广个性化医疗很有帮助。令人惊讶的是，基因组医学在医学培训和临床实践中的使用如此之少。现在，我们的中心每年开设一个针对临床医生的个性化免疫学课程，并为研究生开设了为期两天的课程，教授其如何使用在线工具发现人类基因组中假定的致病基因变异，这些变异已经在我们的流程中运行。但愿基因组医学不久就能被纳入医学课程。
最后，测序成本的下降将对实践带来重大影响，使这些诊断程序更加普遍。
问：您对于研究中的性别平等问题很有热情。您是怎么参与到其中的？
CV：在我有孩子之前，我没有感觉到从事科学工作对女性有什么问题。我认为我可以与任何人一样做好科研工作。但在我第一次怀孕的时候，我很难找到时间写基金申请书来支持我自己和我的研究，这让我感到压力很大。我看到我的同事和博士后也经历了同样的困难时期。她们突然有数年的发表空隙，这会让你拿不到下一笔基金或奖学金。最终，许多女性不得不离开这个体系。
我们对许多应该得到机会的优秀女科学家进行了大量投资。当她们在怀孕期间和抚养孩子的早期放缓科研进度时，她们很容易被这个竞争性极强的体系淘汰，这非常可惜。我现在是国立健康与医学研究理事会（NHMRC）科学界女性工作组的成员，该工作组研究了对女科学家具有重大影响和增加资金的举措。7
现已有一些鼓舞人心的新政策获得了批准，但我暂时不能披露，这有望为申请资金的女性为带来重大的改变。这些政策将在2016年底宣布。我曾在澳大利亚基金和奖学金小组中大力为女性倡导。另外，我还在John Curtin医学研究院建立了性别平等委员会。8我们已经为休完产假后归来的女性设立了第一个全额资助的奖学金。我也为休产假的女科学家设立了性别平等奖，帮助她们育儿或满足其他有助于其提高生产力的需求。
了解更多关于本文所提及Illumina系统的信息：
HiSeq X系列，www.illumina.com/systems/hiseq-x-sequencing-system.html
HiSeq 2500系统，www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.html
参考文献
7.澳大利亚政府，国立健康与医学研究理事会。科学界女性工作组www.nhmrc.gov.au/research/women-health-science.访问日期：2016年6月25日。
8.是澳大利亚国立大学John Curtin医学研究院性别平等委员会。jcsmr.anu.edu.au/about-us/gender-equity.访问日期：2016年6月25日。
*PolyPhen——预测氨基酸替换对人类蛋白结构和功能的可能影响。
SIFT——预测氨基酸替换是否影响蛋白功能。
CADD——对人类基因组中的单核苷酸位点变异和插入/缺失的危害性进行评分