星座映射读取技术简介

简介

新一代测序方法，主要是合成测序 （SBS），在过去 25 年里取得了显著进步，使其成为基因组应用中广泛使用的一种技术。虽然因美纳短读长全基因组测序 （srWGS） 在大多数人类基因组上实现了高度准确的覆盖，1但基因组的特定区域仍然难以解析。此外，一些类别的基因组变异，包括大型结构重排，难以使用标准短读长进行检测。更长的读取长度具有解决其中一些挑战的能力，但相对成本较高且具难以扩展，需要高输入量和严格的样本输入要求。

在这里，我们引入了星座映射读技术，这是一种利用流动槽上文库制备和信息学的创新方法，利用来自相邻纳米井中的簇的邻近信息，使用标准 SBS 测序生成远程基因组见解。星座技术保持了标准 SBS 的准确性、覆盖深度和可扩展性，同时增加了定相、增强了可映射性，并改善了通常与长读长方法相关的结构变异检测。这种新颖的方法为全面的全基因组分析提供了强大、可访问的解决方案。

请参阅本文末尾的术语表。

全新技术

星座技术与其他通过标准短读长测序（例如Hi-C或链接读取）生成长距离信息的方法不同。星座技术通过将提取的 DNA 直接应用于流动槽表面来消除手动文库制备，流动槽表面结合的转座酶可以进行原位切割标记。这种流动槽上的文库制备可确保样本基因组中的相邻区域在流动槽上保持物理邻近。星座技术不依赖于复杂的标记、分子条形码或长连续读取，而是利用相邻簇的空间邻近度，使用标准 SBS 测序从样本基因组中解锁远程基因组信息，从而：

• 在难以映射的区域改进了映射和变异识别
• 超长相位，高达数兆碱基
• 改进了大型 （> 50 bp） 结构重排的识别

工作原理

高度简化的、直接在流动槽上完成的工作流程

星座工作流程始于一种新型的流动槽上的文库制备，使用基于转座体的文库制备流程，只需低 DNA 输入和 NovaSeq X系列的高测序质量。实验流程不需要对测序仪进行任何修改，只需自定义测序配方，即可在现有大量已安装仪器上使用。

星座实验工作流程：

1. 将提取的 DNA 模板添加到文库条带管中
2. 将专用试剂添加到测序卡盒的定制引物孔中
3. 加载耗材并启动运行

定制配方将转座酶结合到流动槽上，然后将完整的双链 DNA 流过流动槽表面，在表面上进行酶切打断（tagmentation），这使得 DNA 与流动槽上的纳米井相结合。附着的 DNA 片段随后经历标准簇生成和 2× 150 bp 测序运行。这种原位打断（in situ tagmentation）大大简化了传统的文库制备流程，并能够在流动槽表面将来自同一DNA模板分子生成的簇聚集在彼此附近。（图 2）。

星座读取映射和邻近度分析

星座技术的优势远远超出了工作流程的简化。通过利用邻近信息，来自相邻簇的读取段被重建为原始DNA模板分子的交错版本。这展示在图3中，其中每个节点代表了一个来自于流动槽簇的读取配对，它们之间的连线提示了基于流动槽和基因组邻近度的组合所预测的它们之间的关联。图3进一步放大了这种交错显示，标明了来自相同原始模板分子的读取段之间的基因组距离，其中模板长度超过300 kb。这些关联是通过临近性模型得出的，这一模型提供了Phred格式的质量分数，描述两个读取段落入某一流动槽位置和给定基因组距离内的概率。分数越高，两个读取段越有可能来自相同的模板分子。这一特性是星座技术独有的，在任何其他 NGS 分析都不具备这一特性。来自相同模板分子的读取段也具有相同的单倍型。这种 Phred格式的邻近质量和一般邻近特征的组合被用于DRAGEN 二级分析，将读取段分配给难以映射的区域、提取定相信息和识别变异。 

星座技术的优势

提高难以映射区域的性能

在基因组的有限区域中，由于高度同源性或其它重复背景，实现标准短读取段的唯一映射具有挑战性，这使得难以区分多个候选映射位置。星座读映射使用来自相邻簇的邻近信息的确可以进行唯一映射，以将读取段分配到正确的基因组位置。

应用邻近度信息可以更自信地绘制基因组图谱并全面覆盖基因组，包括难以映射的临床相关基因，如 STRC 和 PMS2（图 5 和图 6）

由星座技术实现的映射分辨率提升可以延展到小变异体识别性能的提升，特别是在容易出现低覆盖度的基因组难以映射的区域中。使用星座技术，我们看到假阳性 （FP） 和假阴性 （FN） 变异识别大幅减少。这在很大程度上是由基因组难以映射区域的性能显著改进所驱动的——星座技术使错误识别减少了40%，比标准SBS有了相当大的改善（图7）。

超长定相

定相测序通过定义单倍型、识别复合杂合子，能够获得更深入的见解。使用星座技术的定相特别强大，因为它的能力仅由流动槽上捕获的天然DNA模板长度所界定，而不是读取长度，目前可从数百Kb延伸到数Mb。保留较大模板的高分子量 （HMW） 提取方法被证明有助于实现更大的定相块。

使用标准 DNA 提取时，星座定相块 NG50约为 715 kb，使用 HMW DNA 提取时约为 5.7 Mb（图 8）。初步测试表明，通过标准 DNA 提取，星座技术可完全定相约85%的基因（中位数），而通过 HMW DNA 提取则可以实现约95%基因的完全定相（中位数）。此外，在标准和 HMW DNA 提取中，星座技术可对所有杂合 SN的约98%进行定相。

提升结构变异识别

星座技术具有改善的结构变异（> 50 bp）识别的额外获益。使用 DRAGEN v4.3 二级分析，星座技术显示了 结构变异（SV） 识别的显著改善，从使用标准 SBS 的 51.5% 提高到 87.8%（图 9）。

随着星座技术和定制变异识别方法的进一步开发，我们预计在读取映射和小变异及大变异识别方面将有进一步的提升。

基因组结构的新型可视化

星座映射读取技术解决大型结构重排的能力超越了传统变异识别性能的基准。通过从基因组的任何一对区域之间的邻近簇提取关于读取段的信息，基因组结构图的高分辨率视觉表达成为可能，这被称为“共位图”。

这些图是通过将基因组分成区块（bin），并确定每个可能的基因组区块配对的相邻簇中的读取段数量来生成的。当某对区块中来自邻近簇的读取数量较高时，这通常表明这些区块在基因组中具有较近的邻近关系。在没有结构变异的区域中，参考基因组中相邻的基因组区块在样本中也相邻，因此在共位图中显示为对角线。当一个区域内存在结构变异时，参考基因组中附近的基因组区块在样品中不再靠近，因此表现出各种非对角线信号。

图10提供了与X染色体上的F8基因重叠区域的这些共位图的实例，其中图10a示意了不存在SV的样本，而图10b展示了内含子22倒置（inversion）的样本。

也可以在携带倒置的样本中观察到对角线中缺乏信号，这表明倒置边界的任一侧的区域在案例样本中是彼此远离的。

图10b中显示的倒置事件在F8的22号内含子的片段重复中具有一个边界，并且在F8A3中的对应片段重复中具有另一个边界（约500 kb远）。片段重复的长度约为 10 kb，呈反向，并且具有 > 99.7% 的序列相似性。这些特性使得通过标准短读长测序无法检测到这一倒置。 

共位图能够检测和可视化复杂的平衡和非平衡结构重排，即使事件边界发生在基因组难以映射的区域中。

结论和后续

这只是开始。

星座映射读技术是一种功能强大的创新底层技术，具有广泛的功能。我们在这里展示了它在人类基因组测序方面的一些优势，但未来的多个应用还在评估中。基于星座技术的首款商业化产品定于 2026 年上半年推出，并将利用现有的 NovaSeq X 系列测序仪为全面的人类 WGS 创造一个可访问、经济高效的解决方案。

请点击此链接查看 Illumina 首席技术官 Steve Barnard 和 Broad Clinical Labs 首席科学官 Niall Lennon 的 ASHG 2024的演示和早期成果展示。

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参考

1. Behera S、Catreux S、Rossi M等人使用DRAGEN进行全面的基因组分析和大规模变异检测。Nat Biotechnol。2024 年 10 月 25 日在线发布：1-15. doi：10.1038/s41587-024-02382-1

 

术语表

术语	定义
模板分子	从样品中提取的大分子连续双链DNA分子
标准 WGS	使用手动文库制备和标准 SBS 测序进行全基因组测序
酶切打断Tagmentation	使用转座酶切割 DNA 片段和添加接头序列（标记）的过程
转座酶Transposome	以二聚体形式存在的DNA转座酶复合体
簇	流动槽上的DNA扩增点，之后将被测序
邻近簇proximal cluster	在流动槽上彼此物理靠近的簇。
定相块NG50 phase block N50	一旦50%的目标区域（基因组或其它）已经被定相，这时的定相块的长度。请注意，无法对给定目标区域的 50% 进行定相分析的技术的 NG50为0bp。
可完全定相的基因百分比	来自特定来源（例如，NCBI RefSeq、ENCODE、MANE）的基因区域完全包含在单个定相块中的百分比。
可定相的杂合变异百分比	定相杂合小变异的百分比，计算方法为定相的SNV的数量除以杂合SNV的数量。