Index Hopping
最小化多重分析运行的标签跳跃
避免标签交换相关的测序read错误比对的诀窍和最佳操作
什么是标签跳跃？
标签跳跃或者标签交换是一种已知现象，从样本多重分析开发以来就对NGS技术产生影响1。它造成特定类型的错比对，导致文库未能比对到预期标签而是错误地比对到（多重分析库的）另一个标签。
在使用了排除扩增测序化学的图案化流动槽的仪器上可以看到标签跳跃水平略高于未使用图案化流动槽的仪器。文库的接头接头序列水平越高，标签跳跃水平也更高。
通过多重分析提高容量
新一代测序（NGS）技术的进展显著地提高了测序速度和数据产出，实现了当前测序平台的大规模样本通量。 提高容量的关键是多重分析，它在文库制备过程中给每个DNA片段增加名为“标签”的独特序列。 多重分析允许大量温控合并起来，在单个测序运行中同时测序。
多重分析的通量增加，复杂程度也随之增加，因为在最终数据分析前，混合文库的测序read需要在名为“多重分离”的流程中进行鉴别和分类计算。 但是，有了多重分析，无论使用何种文库制备方法或测序系统，都存在标签跳跃的可能性。 标签跳跃可能会导致在多重分离过程中测序read比对到错误的标签，造成错比对。
标签跳跃有什么影响？
虽然可能发生标签跳跃，而且在使用模式化流动池的仪器上可以看到略微升高的水平，但它对大多数应用的影响有限，背景跳跃read可作为噪音被筛除。 图案化流动槽系统的典型标签跳跃水平范围为0.1%-2%，取决于文库的类型、质量和处理方式。 利用唯一双标签序列组合从下游分析中排除跳跃read，因为预期外的组合会被标记为未确定。
诀窍和最佳操作
为让标签跳跃的水平和效应最低，客户应遵照这些最佳的文库制备操作方法：
- 从制备文库中除去接头序列
- 将文库单独保存在-20°C
- 测序前合并文库
- 使用唯一双标签序列合并组合（唯一的i5和i7标签）
Index Hopping Mitigations
Unique dual indexes allow researchers to remove unexpected combinations and only focus on the ‘true’ data with correct index combinations. We are expanding the number of unique dual indexes we offer. Examples of library preparation products that are compatible with unique dual indexes include:
Additional Information
For more in-depth information, see the following resources:
- Understanding UDIs & Associated Library Prep Kits (technical bulletin)
- NGS Tutorials (training and videos)
相关解决方案
图案化流动槽技术
具有定义特征大小的测序簇的固定间隔有助于增加数据输出，降低成本和缩短运行时间。
用标签接头进行多重测序
使用标签接头的样本多重分析极大地增加了单一测序运行中可分析的样本数量。
因美纳培训
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参考文献
- Kircher M, Sawyer S, Meyer M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Res. 2012:2513–2524.