eDNA测序为了解生物多样性变化提供了强大的工具
NGS和eDNA宏条形码技术使研究人员能够准确地监测多种生态系统。
eDNA测序为了解生物多样性变化提供了强大的工具
简介
Michael Bunce教授是澳大利亚珀斯科廷大学（Curtin University）的分子生物学家。尽管他的研究兴趣很广泛，但其所有的项目均围绕着提取、扩增和分析降解DNA领域。他的痕量与环境DNA（Trace and Environmental DNA, TrEnD）实验室对多种类型的样本进行遗传分析研究，包括古生物DNA、草药、葡萄酒、野生动物和海水。
在过去的十年里，Bunce博士采用新一代测序（NGS）来分析环境DNA（environmental DNA, eDNA），以研究生态系统多样性，环境DNA指的是所有生物体释放到周边环境中的DNA。宏条形码结合了DNA条形码与高通量NGS，他的团队正是应用这种技术来分析eDNA样本并监测生态系统随时间的变化。他们最近的研究评估了海洋样本中的生物多样性，以及在采矿或石油勘探后成功恢复自然生态系统的程度。
iCommunity与Bunce博士探讨了他的eDNA研究、它们在环境和生物多样性研究中的价值，以及他如何利用NextSeq 550、MiSeq和iSeq 100系统来研究来自不同生态系统的样本。
Michael Bunce博士是西澳大利亚珀斯科廷大学分子与生命科学学院的教授以及TrEnD实验室负责人。
问：您是什么时候开始将分子生物学技术应用到古生物学和生态学这类传统野外生物学领域的？
Michael Bunce（MB）：2003年，我和同事们发表了一篇论文，文中展示了可以从史前西伯利亚永久冻土核心和新西兰洞穴沉积物中提取出DNA并成功测序。1这是一项具有里程碑意义的研究，它证明我们不需要用化石就能鉴定许多世纪前存在于某个地区的动物。我们可以检测这些动物遗留的DNA，然后再用这些数据来研究动植物是如何随时间改变的。
问：NGS对您的研究有什么影响？
MB：早在21世纪初期，我们进行古生物学研究，分析DNA是很难的。我们必须从样本中提取DNA，将它克隆到细菌，然后再用桑格测序对细菌质粒进行测序，且一次只能检测一个细菌。这很耗时，成本也很高，对样本里物种的挖掘深度也不够。
NGS起到了关键性作用，它让我们能够轻松准确地分析环境样本，进而确定存在过哪些物种。利用细菌克隆和桑格测序，我们只能看到每个样本的少量DNA片段，每个样本的read数通常为50–100。NGS和它的大规模平行测序使每个样本的read数能成千上万，为我们了解多物种环境样本的组成提供了强大的工具。过去十年，我们大量利用基于NGS的宏条形码研究了许多不同的生物基质。我们在TrEnD的研究更多的是为了了解非细菌生物群落的组成和变化，而不是基因组测序。
“在对比不同物种的DNA时，存在许多保守区域。但是，在这些高度保守区域之间有一个高度可变区域，我们可以把它用作条形码来区分不同物种和确定分类群。”
问：什么是eDNA，又是怎样用它来测量生物多样性的？
MB：所有生物体都会在他们生活的环境中留下DNA。这些遗传“面包屑”让我们能够评估任何特定环境中存在或曾经存在的不同生物体。浓缩一升海水中的有机组分并从中提取出DNA后，我们就可以了解该样本中的生物多样性。例如，我们可以设计PCR引物，将它作为分子磁体去吸附鱼类DNA的特定序列，以此来研究海水中存在哪些鱼类。我们可以建立物种列表，然后分析各种分类群是否存在，再利用这些信息来全面了解特定环境中的生物群以及它们是如何相互作用的。
eDNA还可以帮助我们研究难以发现的生物体。例如，海马是海洋中最难以捉摸的鱼类之一。但是，通过检测它们释放到海水中的DNA标记，我们在南非和澳大利亚找到了它们。我们相信，这会改变我们研究海马和其他神秘物种的方式，这些生物伪装得特别好，很难用不具破坏性的方法去研究。
此外，我们可以使用eDNA来全面研究整个生态系统，并将其用作反映生态系统中物种的健康程度和相互联系的一项指标。相反，一旦发生重大污染事件，例如石油泄漏或物种侵入，我们可以利用eDNA检测来分析哪些物种受到了影响并从这些经验中吸取教训。
问：使用eDNA时有哪些常见困难？
MB：最主要的困难在于使用eDNA就像玩一场数字游戏。分析样本就好比是在大海里捞针。比如说，取一升海水或一克泥土作为样本，通常里面99%以上的DNA都来自细菌。我们需要使用一些方法来选择性地富集特定目标。在寻找海水中的珊瑚时，我们的检测方法会与浮游植物有交叉反应，最后检测到的大部分是浮游植物，只有很少或完全没有珊瑚。所以，我们必须设计有效的（PCR）检测方法来靶向特定样本中我们希望检测的成分，并主动排除不想检测的。
我们也需要优化采样方法来富集我们研究的DNA。在评估鱼群时，是海底沉积物还是海水中的鱼类DNA更多？这些信息让我们能够集中目标，只采集含有eDNA的生物基质。我们刚完成了一项珊瑚研究，该研究表明海水中有大量的珊瑚DNA，而海底沉积物中几乎没有。
另一个难题在于提取DNA。我们需要使用高效的DNA提取方法。如果我们使用的方法不佳，可能无法检测出低丰度的物种。
问：在研究环境样本中的生物多样性时，您使用了哪些NGS方法？
MB：我们用了两种NGS方法，一个是鸟枪法测序，另一个是eDNA宏条形码。
如果我们解决了数据量问题，鸟枪法测序是不错的方法。例如检测细菌或浮游植物等小型真核生物。但是，这个方法通常没法用来检测信息量巨大的海水样本。
对于大多数的环境样本，我们使用的是eDNA宏条形码。就像超市里的商品一样，每种生物体都有自己独一无二的条形码。在我们的研究中，它就是DNA条形码。在对比不同物种的DNA时，存在许多保守区域。但是，在这些高度保守区域之间有一个高度可变区域，我们可以把它用作条形码来区分不同物种和确定分类群。
如果是要区分物种，我们会用宏条形码和靶向检测。我们已经将这些eDNA宏条形码方法应用到冰核、沼泽泥土、考古遗址、海水、粪便样本和草药的分析中。eDNA宏条形码的应用非常广泛。
“我们需要创造性地设计和实施检测方法，并根据研究中的植物或动物来进行调整。”
问：什么是生命树（Tree of Life, ToL）宏条形码，您是怎样用这个方法进行海洋生态系统研究的？
MB：ToL宏条形码方法的概念是，单项检测不能为我们提供环境样本的全部多样性信息。在最近的一项研究中，我们获取了一份9升的水样，然后用鸟枪法测序法、细菌宏基因组法、细菌16S测序法和10种不同的分子检测方法进行了分析。2一些检测方法发现了珊瑚，而另一些发现了鱼类。我们研究了单个样本的方方面面，从而分析出不同检测方法的优缺点，同时比较了鸟枪法测序和NGS宏条形码。
我们很快发现，没有哪一项检测能为我们提供这整个生态系统的足够多样性信息，至少在分析海水时是这样。我们需要创造性地设计和实施检测方法，并根据研究中的植物或动物来进行调整。
问：eDNA宏条形码是怎样用来研究生态系统的恢复情况的？
MB：澳大利亚有许多矿场正在恢复其自然生态系统。通常我们会在这些地方种上原生树木，然后等上几年。在这同时，我们并不知道恢复情况是否在按照预期进行。
我们认为eDNA宏条形码可以评估这里过去存在过哪些生物以及应该种植哪些植物。它可以判定该生态系统中原有的昆虫、传粉昆虫和细菌有没有重新回来。3我们可以利用eDNA宏条形码，通过分析粪便、空气和水样来研究存在哪些动物和昆虫。借助这些数据，我们可以为存在于这些环境中的不同动物、植物和昆虫排定生物学秩序，以此来分析我们的恢复工作是否有效。
这类研究的一个主要困难在于正确地设计实验。例如，采集粪便样本后，我们不会逐个分析。而是将所有粪便样本放入一个大的搅拌器中，混合之后再提取DNA。这个过程更节约时间和成本。
“Illumina NGS系统可以提供出色的序列保真度，这对于用宏条形码分析环境样本极为重要。”
问：使用eDNA分析成分时，有没有局限性？
MB：我们从样本中提取的eDNA与存在的生物体数量是否有直接关系，进而是否用于测量丰度，这还存在疑问。由于生物体释放DNA的速率不同，这两者之间不可能有确切的关联。但是，我们可以分析不同区域中的物种是否存在，而且，如果重复分析足够的样本，我们可以利用存在/不存在数据来测量相对丰度。目前，有大量的研究致力于从eDNA数据集中推导出尽可能多的信息。
eDNA分析的另一个局限是我们能否将DNA条形码精确定位到物种依赖于强大的数据库。全世界的研究人员正在构建这些数据库。
问：您对其他想要使用eDNA方法的研究人员有没有什么建议？
MB：eDNA方法可能看起来很简单，但事实上，要用好却很难。随着时间推移，样本污染可能会成为一个现实问题。我建议研究人员认真了解如何在洁净实验室环境中收集、储存和提取DNA，维持所得到数据的保真度。例如，我们在早期研究中发现，2步PCR方法生成的eDNA文库会产生大量杂峰，很容易受到污染。
问：您目前的研究使用的是什么NGS系统？
MB：llumina NGS系统可以提供出色的序列保真度，这对于用宏条形码分析环境样本极为重要。我们需要保证能如实地复制DNA条形码。在实验室里，我们使用NextSeq 550系统来进行所有鸟枪法测序（例如珊瑚和鱼类线粒体基因组）。我们在宏条形码工作流程中使用MiSeq系统来进行扩增子测序，这个系统的单次运行成本非常低。MiSeq系统非常适合我们的ToL宏条形码研究，因为它可以扩增较长的DNA片段，长度可达600个碱基对。
我们最近购买了一套iSeq 100系统。这套系统与MiSeq系统的功能相似，但体积更小，也更加轻便。我们正在使用iSeq 100系统来模拟如何在实验室环境外进行DNA测序。iSeq 100系统让我们能在保持序列保真度的同时快速周转数据，这是其他平台目前无法提供的。
问：您是如何分析eDNA数据的？
MB：在宏条形码工作流程中，我们扩增DNA时在DNA条形码两端加入了类似于车牌的标签序列，使我们能够将DNA read定位到特定的样本。在分析前，我们会去除那些错误的和人为加入的数据。USEARCH和DADA2等生物信息学工具有助于识别这些人为加入的数据，然后将它们从数据集中去除。我们会主动过滤数据，从而减少背景噪声。在获得“干净的”数据集后，我们再用BLAST等比对算法在参考数据库中检索所有条形码。我们可能会使用GenBank或我们自己构建的定制数据库。
eDNA领域的数据分析方法仍在建立之中。有许多方法可以解读数据。关键是如何区分真正的模式和背景杂峰，同时保持检测罕见分类群所需的灵敏度。
“有许多方法可以解读数据。关键是如何区分真正的模式和背景杂峰，同时保持检测罕见分类群所需的灵敏度。”
问：NGS还支持其他哪些eDNA应用？
MB：eDNA具有广阔的应用前景，应用领域不胜枚举。目前有港口监测、生物多样性基线调查、压载水检测、土壤检测、粪便（饮食）分析、发酵动力学和食品/药品成分分析。这些领域还在不断增多。
问：您正在创办一家名为eDNA Frontiers的商业性企业。那您的eDNA宏条形码方法将为客户提供哪些服务？
MB：目前出现了几家提供eDNA服务的商业性实验室。我们的eDNA Frontiers的服务产品将在2019年推出，以店面模式运营，会使用我们过去十年来开发的一些工作流程。4我们的客户将包括那些希望获得海洋或陆地系统规划批准的资源公司和实体。
我们认为eDNA数据可用作监测特定地区生物随时间变化的保险措施。例如，一些客户希望在开始作业之前了解其场地的生态系统。eDNA可以作为一个工具来展示该生态系统中生物产生的正面或负面变化。如果他们的作业对环境有不良影响，他们会及早知道并减轻影响。
我们还在建立eDNA生物样本库，各公司可以将样本提交到这个库，我们会保存十年的时间。5这些样本将作为基线，而数据可以与以后的样本进行比较，以显示环境的变化。
“使用eDNA进行生物监测可以作为全世界负责保护环境的环境保护机构的重要工具。”
问：您对未来eDNA的应用和研究有何展望？
MB：我可能有点偏见，但我觉得eDNA可以发展成最强大的生物监测工具之一，随着这一领域的成熟将变得更加有用。使用eDNA进行生物监测可以作为全世界负责保护环境的环境保护机构的重要工具。他们可以为希望在特定区域开采矿物或石油的公司提供检测。这些公司可能需要在开发前收集场地的环境DNA样本，然后每6到12个月向生物样本库提交样本。如果发生重大事故，例如石油泄漏或者突然出现入侵物种，机构可以利用eDNA样本评估该公司对环境的影响并追究各方的责任。数据将不言自明。
问：您还在从事哪些工作？
MB：我们实验室也热衷于与环境相关的教育和社区活动。我们即将启动一项名为海洋测序（Sequence Our Seas, SoS）的eDNA社区科学项目。我们会到学校教室，为学生提供样本瓶。再让学生去当地的海滩或水道，取1升海水，在教室里从海水中过滤出生物残余物。然后，我们将利用eDNA工作流程分析滤器上的成分并创建存在的鱼类、鸟类和哺乳动物的列表。
这个项目为大家提供了一个渠道，让大家可以了解当地海洋生态系统的生物学特性，这些生态系统正面临多种人为的压力。我们还会给大家讲解遗传学知识，我们认为这一点很重要。
深入了解用于eDNA研究的NGS：
深入了解本文提及的系统：
参考文献
- Willerslev E, Hansen AJ, Binladen J, et al.Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments.Science.2003; 300: 791-795.
- Stat M, Huggett MJ, Bernasconi R, et al.Ecosystem biomonitoring with eDNA: metabarcoding across the tree of life in a tropical marine environment.Sci Rep.2017; 7(1):12240. doi: 10.1038/s41598-017-12501-5.
- Fernandes, van der Heyde M, Bunce M, et al.DNA metabarcoding—a new approach to fauna monitoring in mine site restoration.Restor Ecol.2018; doi.org/10.1111/rec.12868
- eDNA frontiers, Environmental DNA, Biomonitoring Solutions. www.ednafrontiers.com/.Accessed January 9, 2019.
- Jarman SN, Berry O, Bunce M. The value of environmental DNA biobanking for long-term biomonitoring.Nat Ecol Evol.2018; 2:1192−1193.