NGS panel展示了其在脑肿瘤研究中的价值
TruSight Tumor 170能够准确鉴定弥漫性胶质瘤的遗传标记，为临床研究中的肿瘤鉴定提供支持。
NGS panel展示了其在脑肿瘤研究中的价值
简介
延世大学西富兰斯医院成立于1885年，现已成为韩国最大的大学医院之一。它走在医疗实践的前沿，致力于成为东北亚医疗中心。医院临床医生现在每年进行1200多项临床试验。其病理学团队在将新一代测序（NGS）用于临床研究，对疾病进行鉴定和分层方面处于领先地位。
Se Hoon Kim（医学博士）是西富兰斯医院病理科的教授。他擅长神经病理学和评估可靠、快速、信息量丰富的脑肿瘤（如胶质瘤）诊断新工具。胶质瘤约占所有脑和脊椎肿瘤的30%，占所有恶性脑肿瘤的80%。1异柠檬酸脱氢酶（IDH）1和2的突变是低级别和继发性高级别胶质瘤中最常见的突变。2IDH突变检测和鉴定对于胶质瘤患者的临床治疗和预后非常重要。与野生型IDH胶质瘤患者相比，IDH1和IDH2突变肿瘤患者的生存期更长。3尽管IDH1胶质瘤的侵袭性较弱，但它们对治疗不敏感。
Kim博士与科室同事Kiyong Na（医学博士）一起，进行了一项现有金标准方法与在NextSeq™ 550系统上使用的TruSight Tumor 170检测方法的比较研究，检测了胶质瘤活检组织中的IDH突变和其他癌症相关变异。目前检测IDH突变的工具有免疫组化（IHC）和焦磷酸测序。TruSight Tumor 170是一款靶向panel，支持DNA和RNA分析，覆盖了与实体瘤相关的多种基因和变异。与这些现有的方法相比，NGS数据更为理想。iCommunity采访了Kim博士和Na博士，了解了他们的研究以及未来NGS在肿瘤鉴定和诊断中可能发挥的作用。
Se Hoon Kim（医学博士）是韩国首尔西富兰斯医院病理科的教授，Kiyong Na（医学博士）是该科室的工作人员。
问：你们技术评估研究（评估脑肿瘤）的重点是什么？
Se Hoon Kim（SHK）：我们评估新技术，确定它们的速度和可靠性，以及它们提供的信息能否在临床上用于鉴定神经病理学标本中已知的遗传标记。我们的病理学实验室目前使用qPCR、桑格测序和荧光原位杂交（FISH）来评估肿瘤活检样本。全世界的公司和研究实验室都在持续开发新的分析技术。我们进行了相关性研究，确定与我们的金标准程序相比，这些新方法的准确性、可靠性、性价比和可能的周转时间。
问：你们什么时候开始在脑研究中使用TruSight Tumor 170和NextSeq 550系统？
Kiyong Na（KN）：我们从2017年开始使用NextSeq 550系统，当时韩国政府对基于NGS的检测提供选择性报销。
SHK：我们没有用基于NGS的检测鉴定新突变，而是鉴定或确认具有诊断或个性化治疗前景的标记。
KN：例如，我们用TruSight Tumor 170的BRAF数据重新评估了肿瘤样本的亚型。另外，我们用TruSight Tumor 170数据重新进行了杂合性丧失（LOH）评估。
我们还使用NextSeq 550系统检测了融合变异、表皮生长因子受体（EGFR）扩增和在胶质母细胞瘤过表达的EGFRvIII突变。此前，我们使用FISH检测EGFR扩增。我们使用TruSight Tumor 170和NextSeq 550系统检测的EGFR扩增与全球报告的趋势一致。
问：你们使用TruSight Tumor 170 Panel和NextSeq 550系统进行胶质瘤活检样本研究的参数是什么？
SHK：我们对NextSeq 550系统上的TruSight Tumor 170和一直使用的其他分子诊断方法进行了一项比较研究，评估了弥漫性胶质瘤（脑肿瘤）特定亚群的临床相关遗传变异。弥漫性胶质瘤是成年人中最常见的脑肿瘤，其特征是神经纤维网中肿瘤细胞的弥漫性浸润，以及神经细胞和胶质细胞突起相互交织形成的致密网络。
KN：我们收集了去年收到的所有弥漫性胶质瘤样本，用TruSight Tumor 170在NextSeq 550系统上重新分析了200多份样本，将其变异检测性能与我们的标准方法进行了比较。
表1：比较研究数据——弥漫性胶质瘤样本的IHC、焦磷酸测序和NGS分析。
基因/变异/检测方法 | 比较的检测方法 | 新一代测序 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
IDH1 IHC | 135 | R132H | 其他突变 | 野生型 | 一致率 | ||
R132H突变 | 38 | 38 | 0 | 0 | 100% | ||
| R132H野生型 | 97 | 0 | 0 | 97 | 100% | ||
BRAF IHC | 17 | V600E | 其他突变 | 野生型 | 一致率 | ||
VE1突变 | 5 | 5 | 0 | 0 | 100% | ||
VE1野生型 | 12 | 0 | 1 | 11 | 100% | ||
IDH焦磷酸测序 | 48 | IDH1突变 | IDH2突变 | 野生型 | 一致率 | ||
| IDH1突变 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100% | ||
| IDH1野生型 | 48 |
| 0 | 0 | 48 | 100% | |
| IDH2突变 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100% | ||
| IDH2野生型 | 48 | 0 | 0 | 48 | 100% | ||
TERT焦磷酸测序 | 135 | TERT突变 | 其他突变 | 无结果 | 一致率 | ||
C228T突变 | 53 | 53 | 0 | 0 | 100% | ||
C250T突变 | 17 | 17 | 0 | 0 | 100% | ||
野生型 | 65 | 0 | 3 | 62 | 100% | ||
问：弥漫性胶质瘤样本的比较研究的结果如何？
KN：我们研究中最重要的靶基因是IDH。此前，我们使用IHC或焦磷酸测序分析收集的弥漫性胶质瘤样本。TruSight Tumor 170成功报告了是否存在IDH变异，该方法与既往分析方法的一致性为100%（表1）。检测到的IDH变异都是R132H，它是脑肿瘤中最常见的IDH突变。令人鼓舞的是，TruSight Tumor 170稳定地检测出了最常见的IDH突变。此外，TruSight Tumor 170的鉴定结果与免疫组化方法观察到的TP53和BRAF突变水平相似。
我们还比较了TERT启动子突变状态的焦磷酸测序数据和NGS数据。C228T和C250T变异是TERT启动子区最常见的变异。TruSight Tumor 170的数据与传统焦磷酸测序的一致性良好，另外还检测出了焦磷酸测序未检出的若干次要变异。TERT启动子突变的检测对弥漫性胶质瘤至关重要。然而，由于read深度欠佳，TERT启动子区的C228T变异通常排除在*.vcf文件之外。因此，必须使用Integrated Genome Viewer（IGV）在此基因组区域仔细观察该变异。我们很想弄清楚是什么原因导致了该区域的覆盖度欠佳，我们还发现其他NGS panel报道的TERT启动子区的read深度也较低。已有研究表明，TERT启动子区极高的GC含量可能与此问题相关。
一项有趣的发现涉及1p/19q联合性缺失。利用TruSight Tumor 170，我们观察到大部分少突胶质细胞瘤的1p和19q基因存在显著的拷贝数丢失，包括NRAS1、MYCL1（1p），以及CCNE1、AKT2、ERCC1和ERCC2（19q）。这与我们少突胶质细胞瘤样本的FISH数据一致。此数据表明，这一聚集的拷贝数丢失可能反映了1p和19q基因的缺失。如果TruSight Tumor 170包含位于1p和/或19q区域中的更多基因，此数据将更有意义。
“令人鼓舞的是，TruSight Tumor 170稳定地检测出了最常见的IDH突变……与免疫组化方法观察到的TP53和BRAF突变水平相似。”
问：更广泛的TruSight Oncology 500 panel能解决你们使用TruSight Tumor 170 panel发现的问题吗？
SHK：TruSight Tumor 170是一款集中的panel。因此，它在进行评估脑肿瘤所需的全面遗传图谱分析方面有一些限制。
我们相信，随着最近TruSight Oncology 500 panel的引入，这些问题已经得到了解决，TruSight Oncology 500 panel是一款覆盖500多个基因的泛癌症panel。它比TruSight Tumor 170更全面，可同时分析多种类型的生物标记，包括单核苷酸位点变异（SNV）、插入缺失、扩增、融合和剪接变异。它还可以检测肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）状态，这是未来支持免疫肿瘤学疗法的重要生物标记。4
问：你们在研究中如何分析TruSight Tumor 170的数据？
KN：TruSight Tumor 170的数据分析基于*.vcf文件。我们与延世病理科的其他成员一起设置了一些内部过滤标准。变异的最终选择是使用内部过滤和选择标准手动完成的。
在一些情况下，我们发现由于单核苷酸缺失和复制的变异检出算法的混淆，变异检出可能不符合标准命名法。这可以通过将千人基因组计划（韩国）的数据整合到数据过滤过程，或者使用该数据作为正常参考数据来解决。这可以显著提高韩国人样本中体细胞变异检出的准确度。
问：将NGS与甲基化芯片结合用于评估脑肿瘤样本有价值吗？
SHK：我相信，使用NGS进行体细胞突变分析将成为临床实践的常规操作。我也相信，脑肿瘤的全面遗传图谱分析将受益于甲基化芯片分析。德国癌症研究中心（DKFZ）David Capper博士的项目就是一个例子，该项目使用了Infinium™ HumanMethylation450K和MethylationEPIC芯片对脑肿瘤样本进行甲基化分析。5
我们在韩国遇到的问题是甲基化芯片还不能报销，这限制了我们能获得的临床研究（研究甲基化芯片在鉴定脑肿瘤突变中的用途）经费。另外，在运输和必要的国际性共享临床/遗传数据以支持国际合作这些方面也存在一些监管问题。
“我们对全新的TruSight Oncology 500 panel很感兴趣，它更全面，能够同时分析多种类型的生物标记。”
问：韩国NGS遗传评估的法规和报销是怎样变化的？
SHK：根据韩国政府最初的声明，2018年底将对基于NGS的临床试验的选择性报销项目进行审查。这个问题在韩国脑肿瘤患者和家庭中备受瞩目。患者游说团体正在推动高科技诊断测试（例如NGS）以及新的脑肿瘤药物普及到个人。目前，韩国政府监管的公共医疗保健支持系统不提供这些。
问：NGS的普及对你们意味着什么？
SHK：我认为有有利的方面，普及将为普通病人提供全面和普遍获取NGS的途径。它将使获取全面的NGS数据和NGS分析技术变得容易，缩小实验室和临床之间的差距。
但是，我对于世界上高科技医疗工具的可及性存在疑虑。目前，NGS或其他高科技医疗工具在不同经济阶层之间、在发展中国家/地区和发达国家/地区之间存在差距，而在未来这种差距可能会变得越来越大。其他新的、昂贵的治疗方法或药品也可能发生同样的情况。我关心的是如何限制NGS工具、诊断和疗法的可及性和质量在不同社会阶层和国家/地区之间的差距不断扩大或者两极分化。
问：你认为NGS和肿瘤学的下一个发展方向是什么？
SHK：NGS技术在临床实践中的应用将是不可避免的。PCR的接受就是一个很好的例子。20年前，我不相信PCR会成为临床实践中必不可少的技术。然而它确实做到了。同样的事也会发生在NGS技术上。我们收到的医院临床研究样本NGS分析的申请已经在快速增加。
问：您希望在未来使用哪种类型的NGS癌症panel？
KN：我们对全新的TruSight Oncology 500 panel很感兴趣，它更全面，能够同时分析多种类型的生物标记。它非常适合作为开发新疗法伴随诊断的基础。我们期待着有机会尽快在韩国测试和验证该panel。
我们还希望看到用将实体瘤分成几类的必要基因构成的新NGS panel，例如I类或II类实体瘤panel。新的具有临床意义的脑肿瘤靶基因panel也能帮助我们进行临床研究。
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参考文献
- Goodenberger ML and Jenkins RB.Genetics of adult glioma.Cancer Genet.2012; 205: 613–621.
- Cohen A, Holmen S, and Colman H. IDH1 and IDH2 Mutations in Gliomas.Curr Neurol Neurosci Rep.2013; 13:345.
- Garrett M, Sperry J, Braas D, et al.Metabolic characterization of isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant and IDH wildtype gliomaspheres uncovers cell type-specific vulnerabilities.Cancer Metab.2018.6:4 doi: 10.1186/s40170-018-0177-4.
- Buchhalter I, Rempel E, Endris V, et al.Size Matters: Dissecting Key Parameters for Panel-Based Tumor Mutational Burden (TMB) Analysis.Int J Cancer.2018. doi: 10.1002/ijc.31878.
- Hench J, Bihl M, Bratic Hench I, et al.Satisfying your neuro-oncologist: a fast approach to routine molecular glioma diagnositcs.Neuro Oncol.2018.12: 1682-1683.