微生物组研究正当时

简介

自从Joseph Petrosino博士在1993年来到贝勒医学院之后，他连续三次在正确的时间找到了正确的位置。每一次都朝着微生物学研究从学术界到商业领域的起步和扩展迈出了一步。

首先，宣布共同基金人类微生物组计划（HMP）时，他在贝勒人类基因组测序中心工作。由于它是美国国家人类基因组研究所（NHGRI）的项目，基因组中心在启动阶段就担任了先锋的角色。人类基因组测序中心主任Richard Gibbs邀请Petrosino博士帮助该中心完成贝勒医学院的项目。具有细菌基因组学背景的Petrosino博士“对利用新一代基因组学平台非常感兴趣，该平台可以对任何类型的样本进行微生物的普查和功能研究，而不需要培养它们。”

2010年，HMP的工作接近尾声时，Petrosino博士带着建立转化微生物组研究中心的想法来到了贝勒医学院。其目标是越过基因组学和基于发现的流程，直接进行宿主-微生物关系的解析，特别是建立微生物群落功能与疾病的联系。一年后，宏基因组学和微生物组研究中心（CMMR）成立，由Petrosino博士担任主任一职。

不久，CMMR收到了制药企业的请求，希望该中心能协助其开展微生物组项目。为了应对商业项目更加紧迫的截止时间，贝勒医学院在2015年创建了微生物组服务公司Diversigen。Petrosino博士是该公司的首席科学官，他将约10%的时间花在Diversigen的项目上，其余90%的时间用于领导CMMR。

Petrosino博士说，CMMR“从Diversigen的活动中获益良多”。“作为一个商业实体，Diversigen能让CMMR团队将其专业知识与处于新疗法和新诊断开发一线的人们联系起来。因此，它加速了CMMR的学术成果向有益的商业产品的转化。”最近，Diversigen被Orasure Technologies收购，由他们提供端到端的微生物组分析服务。

iCommunity采访了Petrosino博士，了解了微生物组研究的价值、研究设计策略、NGS的使用在过去十年中的演变，以及未来的发展趋势。

Joseph Petrosino博士是CMMR主任兼Diversigen首席科学官。

Q: 人类微生物组计划最初的愿景是什么？

Joseph Petrosino (JP): There were many investigators around the world who were studying commensal organisms and who had begun implementing next-generation sequencing (NGS) technologies for microbiome studies. The NIH recognized that the microbiome could impact many disease areas and that would impact numerous NIH institutes. They also realized that there was a need for developing methodologies, strategies, and best practices concerning which tools were best suited for microbiome studies and for what purposes. The HMP effort closely paralleled the Human Genome Project in terms of gathering data, understanding best practices and methods, and developing a reference data set and prot全世界有许多研究人员在研究共生生物，并开始将新一代测序（NGS）技术应用于微生物组研究。NIH意识到微生物组能影响许多疾病，而这将对许多NIH机构产生影响。他们也意识到，有必要制定关于哪些工具最适合微生物组研究和相关用途的方法、策略和最佳实践。HMP计划与人类基因组计划在某些方面非常相似，例如收集数据、了解最佳实践和方法，以及开发研究人员可以用来构建自己的研究项目的参考数据集和实验方案。

Q: 在建立HMP实验方案的过程中，您了解到了什么？

JP: 我们在HMP计划中的工作重点是建立一个由300名受试者组成的队列，他们分别来自贝勒医学院和圣路易斯华盛顿大学这两个核心临床中心。我们在临床方面花了很多时间用来制定招募方案。我们将对这300名受试者在多达18个身体部位进行采样，在12个月内采样多达3次。

从方法学的角度来看，我们确定了可以用于收集的多种样本类型的最佳提取方法。了解如何评估和验证这些实验方案比我们最初认为的要更加精细和严格。我们从这300名受试者中观察到的第一个结果是尽管人和人之间的生物体多样性不同，但每个身体部位的功能成分都是保守的。

Q: Diversigen成立的原因是什么？

JP: 建立宏基因组学和微生物组研究中心是为了在医学中心的环境下进行转化学术研究。但是，有几个制药商业团队带着微生物组项目来找我们。虽然他们支持学术研究，但他们不太满意这种环境下的研究，例如他们不喜欢由一个一年级的研究生来完成他们的项目。他们希望项目能在更短的时间内，由能够解决问题和分析数据集的资深人员来完成。Diversigen成立于2015年，旨在解决商业实体对微生物组研究的需求。

建立这个中心时，我就指出了建立微生物组服务公司的潜力，它可以为我们提供了一个窗口，让我们了解制药企业如何看待微生物组。作为学者，我们总是认为我们对自己的领域最了解，也知道领域该如何发展才能最好地服务公共卫生。但制药企业可能有非常不同的观点。Diversigen为我们提供了了解这些观点的窗口，改变了我们对微生物组的理解。它从一开始就是一个有意义的项目。

"NovaSeq 6000系统的多重分析功能对我们有很大的帮助。我们将继续使用NovaSeq开展更多的应用。"

Q: Diversigen的独特之处是什么？

JP: Diversigen为自己是一家顶级的微生物组服务提供商而感到自豪，我们为商业客户，尤其是制药和生物技术公司提供服务。学术实验室几乎可以看作Diversigen研发部门的一部分，能让公司提供最先进的前沿应用和成熟的策略，生成与我们的学术成果相媲美的数据。Diversigen建立了大规模的内部分析团队，开发了自己的最适合商业研究的最佳实践。

Diversigen团队从概念阶段到结果乃至其他方面都会与客户保持联系。我们合作进行研究设计，提供采集、储存和运输样本的建议，并推荐能提供他们所需结果的最佳测序方法。

微生物组公司明显增多，许多是由直接来自学术界的微生物组专家创建的。但许多这样的公司，特别是制药领域的公司，没有核心的微生物组分析专家。我们已经完成了400多项学术项目，在全世界有200多个合作者，我们对各种疾病和微生物组在其中的潜在作用有深入的认识。这些公司依靠Diversigen团队来为他们提供反馈、建议，并就后续步骤和潜在的下游应用与他们进行协商。

Q: Diversigen项目的平均样本数量是多少？

JP: 我们进行过5–20个样本的研究。目前，我们的大部分项目有数百个样本，有些项目有数千个样本。我们建立了管理纵向采样的大型队列项目的最佳实践。这包括如何采集、储存和批量处理这些样本以实现最大效率，同时降低数据中的噪音。

Q: 你们参与制药客户的临床试验吗？

JP: 一开始与制药企业合作时，我们就会开始开发临床实验室改进修正案（CLIA）和美国病理学家协会（CAP）认证的流程。我们希望制药客户能够感到满意，我们生产的数据质量高、可重复、经过了验证，非常适合用于监管提交。

我们的几家制药企业合作伙伴已经进入了临床试验阶段，我们正在为其中一些试验进行测序和分析。这些项目通常耗时多年，我们会采用其他最佳实践，以便从获得的数据中提取尽可能多的信息。

Q: 你们通常会收到什么类型和规模的样本？

JP: 微生物组领域最常见的样本类型仍然是粪便。稳定剂的出现意味着不再需要在冰上运输样本来保持样本的稳定性，这让事情变得更加容易。

当然，我们有许多项目会收到不够理想的低生物量样本。但我们有建立HMP实验方案的专业经验，有成熟的团队来开发和验证困难样本类型的实验方案。我们的目标是从收到的任何类型的样本中获取有意义的数据，无论其大小如何。

"们的周转时间是几天，不会长达几周。Illumina NGS系统能让我们提前计划项目，使测序仪持续运行。"

Q: Diversigen的项目中会使用哪些种类的测序？

JP: 我们会对16S基因内的多个可变区进行16S测序，具体取决于需要分析的群落。对特定的群落类型，例如口腔、皮肤和粪便，某些可变区具有更好的分辨率。

我们会对真菌和真核生物群落进行内部转录间隔区2（ITS2）测序，并对真核微生物进行18S测序。我们会使用全基因组鸟枪法测序来进行宏基因组分析、微生物群落株以及物种水平和功能水平的鉴定。我们也会进行长read测序。根据问题和应用的不同，有时我们会同时使用长read测序和短read测序来为单株测序提供更好的测序质量，就像过去一样，但是现在更快、更便宜。

我们有转录组学或宏转录组学分析流程，我们正在从方法学和分析的角度继续对其进行优化。病毒宏基因组学也是我们工作的重要组成部分。我们花了大量的时间来加强我们从临床角度分析病毒宏基因组样本的能力。某些样本非常小，像在传统病毒学实验室中使用离心和梯度沉降的方法来纯化病毒是不可能的，这种方法也不可扩展。在样本处理中，我们使用了“少即是多”的方法，我们会利用分析尽可能多地从这些困难样本获得病毒信息。

Q: 在过去的五年中，研究设计策略和NGS的使用如何演变？

JP: 在早期的微生物组研究中，例如在HMP中，人们经常会利用为其他目的收集的样本来对特定队列进行横向分析，而非纵向分析。 样本可能未根据微生物组分析的要求正确采集或储存，并且我们知道，单个时间点分析并不总是能提供给定微生物群落中正在发生的全部情况。现在，越来越多的项目涉及特定疾病匹配的病例和对照，并会使用临床前模型来分析微生物与健康和疾病相关的功能机制。

同时，随着公司认识到了16S测序的局限性，并提高了基于微生物组的研究的预算，我们看到了他们逐渐开始使用全基因组鸟枪法测序来获得基于功能基因通路和菌株的信息，从而更好地研究存在的微生物群落。同样，我们也看到公司更多地使用转录组学方法，该方法能评估在收集样本的特定时间开启了哪些基因。

"根据典型微生物组项目的规模，NovaSeq 6000系统的容量能在较长时间内支持我们的业务。"

Q: 宏基因组学和转录组学数据能提供关于疾病的哪些信息？

JP: 宏基因组学和宏转录组学能让我们确定健康个体中存在哪些微生物和功能，或者与特定疾病相关的微生物和功能，以及它们与该疾病相关的机制。利用纵向样本，数据可以与疾病的发生或恶化关联起来。而且利用转录组学可以评估基因表达是否与特定疾病或恶化状态相关。

Q: 宏基因组学和转录组学研究的数据能为治疗或诊断开发提供靶点吗？

JP: 是的，值的注意的是，基于组学的方法能够发现靶点。我们意识到，我们需要回过头进行机制和功能研究，创建或利用临床前模型来理解为什么存在基于组学的差异，以及它们如何影响疾病本身。这些研究的数据有助于决定是否采用潜在的治疗或诊断候选药物，并提供候选药物是否影响微生物组的信息。

Q: 自2015年以来，你们的客户群增长了多少？

JP: 我们的客户群一直呈指数级增长，而且没有放缓的迹象。创建和发展基于微生物组的疗法的公司数量激增。制药企业也开始采用药物微生物组学，即微生物组如何代谢药物。因此，即使是化学药物的开发者也对它们是否被微生物组修饰感兴趣。

Q: 你们在使用哪些Illumina NGS系统？

JP: 我们有一台iSeq™ 100系统、几台MiSeq™系统、一台NextSeq™ 500系统、一台HiSeq™ 3000系统和一台NovaSeq™ 6000系统。从我们实验室的角度来看，我们很喜欢它们，它们为我们提供了很大的灵活性。

项目的读长、数据和多重分析需求决定了我们使用哪个流程。我们使用iSeq 100系统来进行质量控制和新实验方案的验证。它也为我们提供了经济高效的工具，能以更快的周转时间来进行噬菌体或小型基因组测序项目。我们使用MiSeq系统来进行基于扩增子的测序。NextSeq 500、HiSeq 3000和NovaSeq 6000系统用于进行RNA-Seq和宏基因组测序。我们还对多种机器人处理器和一台Echo仪器进行了验证，它们能帮助我们构建测序文库。

Q: NovaSeq 6000系统在你们的研究中表现如何？

JP: 我们最近刚刚购买了NovaSeq 6000系统，它不同的流动槽能让我们灵活地完成项目所使用的测序类型。就像我所说的，它运行良好，还添加了新的条形码。NovaSeq 6000系统的多重分析功能对我们有很大的帮助。我们将继续使用NovaSeq开展更多的应用。它的到来让我们非常兴奋。

"我们使用iSeq 100系统来进行质量控制和新实验方案的验证。它也为我们提供了经济高效的工具，能以更快的周转时间来进行噬菌体或小型基因组测序项目。"

Q: 测序效率重要吗？

JP: 效率对于Diversigen的成功至关重要。我们有一支由12–17人组成的经验丰富的小型团队，参与从样本接收到初级分析的整个过程。我们的周转时间是几天，不会长达几周。Illumina NGS系统能让我们提前计划项目，使测序仪持续运行。

Q: 你们未来5年在CMMR和Diversigen的目标是什么？

JP: 我们希望继续增长，并且对开发一些CMMR项目的知识产权（IP）感兴趣。在CMMR，我们参与了癌症免疫疗法和社交焦虑等项目，并进行了多项临床研究。我们希望找到相应的方法，将这些初步观察应用于建立队列，帮助我们发现更多候选物，通过贝勒/Diversigen的合作关系来进行诊断和治疗的开发。Diversigen也希望通过其开发的技术和分析方法使公司的IP驱动程度更高。

Q: 您认为NGS和Illumina测序系统对Diversigen未来的微生物组研究有什么影响？

JP: 短期内，扩增子测序是分析群落的好方法。随着测序成本的下降，我们也将越来越擅长进行多重分析、建立分析方法以及发现生物标记，能更有效地分析微生物群落，从16S测序到全基因组鸟枪法测序的迁移还将继续。

根据典型微生物组项目的规模，NovaSeq 6000系统的容量能在较长时间内支持我们的业务。随着商业业务的增长，我们可能需要第二台系统来确保我们的多重分析项目开展速度能实现最佳的周转时间。

深入了解本文提及的产品和系统：

NovaSeq 6000系统, www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html

iSeq 100系统, www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/iseq.html

NextSeq 500系统,* www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/nextseq.html

MiSeq系统, www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html

*NextSeq 500系统已升级为NextSeq 550系统。