分子诊断实验室中不断变化的NGS实施

简介

新一代测序（NGS）技术加快了人类疾病相关变异的发现，特别是癌症相关突变的发现。其中一些研究结果成为了目前用于全世界的分子诊断实验室的比较诊断和实验室自主研发的检测方法（LDT）的基础。这些实验室目前面临着NGS肿瘤检测不断变化的法规和报销策略环境。

最近在新加坡召开的Illumina用户会议上，来自全世界的关键意见领袖参与了关于NGS检测现在和将来对肿瘤学影响的小组讨论。小组成员包括：Lawrence Jennings，医学博士，西北大学范伯格医学院；Simon Patton，博士，欧洲分子基因诊断质量联盟；Min-Han Tan，医学和外科学士，博士，Lucence Diagnostics公司；Benedict Yan，医学和外科学士，新加坡国立大学医院。观众通过一系列投票问题参与了小组讨论，包括从新的政府检测标准到NGS检测频率的各种问题。¹在此，我们记录了他们对全球分子诊断实验室中不断变化的NGS实施和面临问题的一些看法。

从左至右：Lawrence Jennings，医学博士，主治病理医师，主任，HLA和分子诊断实验室，西北大学范伯格医学院；Simon Patton，博士，主任，欧洲分子基因诊断质量联盟（EMQN）；Min-Han Tan，医学和外科学士，博士，创始人兼CEO，Lucence Diagnostics公司；Benedict Yan，医学和外科学士，病理医师，主任，分子诊断中心，新加坡国立大学医院。

问：您认为分子遗传学实验室用多基因NGS panel取代单基因检测的速度有多快？

Lawrence Jennings（LJ）：据调查，大部分受访者认为他们将来会切换到多基因NGS panel。实验室从单基因检测切换到多基因NGS panel检测的原因有两个。首先，他们知道最终需要对单个样本进行多基因检测。其次，NGS panel检测的工作流程比进行多个单基因检测简单。

Simon Patton（SP）：NGS只是一项技术，而真正重要的是想要知道的临床问题。如果使用NGS panel与回答临床问题无关，那为什么要进行NGS？如果能直接检测疾病中明确存在的3个确定的反复突变，则不需要使用更广泛的NGS panel。关键在于使用正确的工具，或者正确的技术来提供正确的答案。

LJ：报告的内容也是一个问题。从临床实用性角度，实验室临床医生可能知道需要分析样本中BRAF、EGFR、NRAS和KRAS的临床相关性。显然，同时分析它们更容易。就像我们在一个投票中看到的结果（图1），肿瘤学家需要使用大型panel。如果实验室使用50个基因的靶向panel或170个基因的全面panel，那么问题将是报告中应当包括哪部分基因。他们是报告50个基因，还是包含KRAS、NRAS、BRAF和EGFR的一组基因？

Min-Han Tan（MHT）：我们在多个国家运营，理解亚洲、欧洲和美洲的报销差异很重要。在亚洲，大部分昂贵的诊断和药物是自费的。因此，在亚洲的很多地区，连续检测依然很重要。

我同意工具必须适合临床情况。连续检测在某些情况下仍然有意义。在活检样本难以获得或者质量差时，NGS panel具有显著的优势。关键问题始终是如何、何时提供最大的临床效益。

问：投票受访者选择未知重要性的变异（VUS）、成本、结果准确性和结果解读作为他们关注的与癌症panel检测相关的方面（图2）。您同意吗？

MHT：这取决于癌症panel是生殖系还是体细胞检测。对于生殖系检测，一个主要问题是VUS，它根据医生的背景技能和临床训练可能有所不同。对于体细胞检测，VUS不是那么急迫的问题，因为大部分可利用突变非常清楚。

LJ：结果解读可能是个问题，特别是如果有出乎意料的变异。那么问题将会变成‘我们已经知道了这个变异的存在，要怎么使用它？’

SP：在我的熟练度检测（PT）方案中，我发现准确性是个问题。我们看到许多错误，特别是在肿瘤学以及新的检测开发和实施领域。我们的平均基因分型错误率仅低于3%。而实施许多新的肿瘤检测时，错误率约是25%。因此，每四个检测结果就有一个是错误的。值得警惕的是这是外部质量保证（EQA）方案的结果，实验室知道这是EQA样本。在临床情况中的真实错误率是多少？它低于25%，但高于我们的预期。

图1：调查结果——肿瘤学家要求何种水平的检测复杂度？¹

问：决定使用哪种检测时，每个可报告结果的成本的影响有多大？

MHT：NGS panel的成本取决于医疗保健系统和报销方法。一些美国医疗保健系统已经覆盖了NGS panel。而在亚洲，大部分NGS panel是自费的。在肺癌中，NGS panel可以通过缩短获得答案的总时间来降低成本，或者减少患者液体活检的流程，从而降低成本。鉴于NGS panel明确的临床效益，随着时间的推移，NGS panel验证得到进一步改进，FDA和CFDA审查更多的提交材料，获得NGS panel的机会也将增加。

Ben Yan（BY）：成本绝对是一个重要的问题。最近的美元升值影响了新加坡的试剂成本，每个患者的成本增加了50新加坡元。

LJ：从我的角度，价值更加重要。成本基本由供应商决定，他们根据市场设置试剂成本。这反映了检测提供的价值，更反映了报销的情况和竞争对手的试剂成本。如果两个检测的价值相同，成本才会成了为一个考虑因素。其他因素例如平台和工作流程的标准化也有影响。

问：参与者还回答了一个多选题，即应在何时对癌症患者的癌症样本进行测序——诊断、复发、非靶向治疗方案用尽时或完全不进行（图3）。答案在诊断、复发和非靶向治疗方案用尽时之间均匀分布。您同意吗？

LJ：对于实体瘤，我认为在所有三种情况下进行测序都有意义，特别是诊断和复发的阶段。

BY：对于血癌，在白血病根除之后测序很合适，但应在患者复发前进行。测序也许能显示还有哪些突变存在。

LJ：我们有医生在移植后或在患者的缓解期订购NGS panel进行骨髓检测。大部分NGS panel适用于诊断，检测限是5%。对于移植后和缓解期检测，需要专门的靶向微小残留疾病（MRD）相关变异的panel。大部分检测适用于诊断，不是MRD检测。对于MRD检测，panel的检测限必须是0.1%或更低，意识到这一点这很重要。

图2：调查结果——对于癌症panel检测，您最关注什么？¹

问：目前，肿瘤突变负荷（TMB）检测不完全有预测性，不同的TMB检测提供的结果不同。TMB检测的EQA情况怎么样？

SP：我们计划开发TMB的EQA。由于您提到的原因，我们正在进行调查，了解实验室如何进行和解读TMB。高TMB结果和低TMB结果的定义仍不明确。10是随意确定的界限值吗？TMB是根据一次临床检测还是两次TMB检测的比值确定？

我们正在与国际病理学质量联盟（IQN Path）合作，推动TMB检测的EQA开发。我预计这不会很快，因为实验室还在研究如何测量TMB，医生也苦恼于如何解读TMB检测数据。

问：作为一个社区，我们可以做些什么来协助建立NGS肿瘤panel的临床有效性、实用性和成本效益的证据？

MHT：我们是公共和私人利益相关者以及国际EQA机构的全球社区，致力于获得高质量结果并降低患者成本。研究人员启动的试验（IIT）、制药企业启动的试验或者政府支持的研究可让我们获得临床有效性和实用性数据。但是，成本效益的问题颇有挑战性。它可能随不同地区的报销情况而变化。每个地区通常会进行自己的成本效益分析。UK NICE是成本效益分析领域的著名权威机构，它作出的良好分析在其他国家仍将根据具体情况进行评估。

LJ：这一切都归结为准确的数据。我们在进行临床有效性分析前需要分析有效性数据，在进行临床实用性分析前需要有临床有效性数据。但是，我们对于作为分析有效性的NGS数据还没有完全的信心，所以对于临床有效性没有信心。

生殖系变异领域有ClinVar数据库，它增长快速，可用于确定临床有效性。此前，我们有人类基因突变数据库（HGMD），它是经人工审核的数据库，包含文献中检出的变异。遗憾的是，HGMD中约三分之二的检出是过度检出，因此该数据库没有用。相反，实验室向ClinVar上传了关于疾病相关变异和表型之间关系的数据。它是自由资料库，易于检索，包含有用、注释清楚、分类良好的变异信息。

我认为体细胞变异领域可以建立类似的数据库。在某种程度上，cBioPortal和OncoKB数据库具有这一特点。建立导入数据的标准结构带来了挑战。

SP：对于临床验证，我们需要一致的数据标准和命名法以确保我们在谈论同一事物，即哪个变异对应哪个表型。否则我们所说的数据库都无法工作。

我认为撰写最佳实践指南对组织非常重要。我们是努力为患者提供最好的治疗，并获得正确结果的实验室团体。我们需要共同努力，改进实施NGS panel的实验室指南。

图3：调查结果——癌症患者应在哪个阶段进行NGS测序？¹

问：要在专业的参考中心以外广泛应用NGS需要哪些必要的改变？

MHT：主流市场检测的一个重要方面是初级医生的水平。在美国，Regeneron Genetics Center公司和Geisinger Health System公司进行了合作，目标是招募250,000人进行外显子组测序，专注于了解充分的可预防疾病。²其目标是每年测序和分析100,000个外显子组。在某些方面，我们正在进入科学算命的领域。这些信息的意义随着对临床医生教育的需求而不断发展。我们做得还不够好。事实上，有文献表明，在资源丰富的国家例如美国，三分之二的BRCA检测是在没有遗传咨询的情况下进行的。医学界应该如何确保人们正确理解和解读结果？工作的重点难道不应该是确保临床和患者获得足够的教育，以便双方就疾病预防进行正确的交流吗？Geisinger Health System在推动讨论，建立促进与人们交流的基础方面做得很好。

SP：遗传学将变得更加主流。看看过去十年NGS的增长。过去5–6年间，仅仅是肿瘤学领域就已显著增长。我预计，随着患者床侧遗传学检测的发展，即时检测会有显著的增长。这些快速检测可以为患者的医疗决策提供信息，加快其制定过程。随着遗传学成为主流医疗的一部分，我们需要更多针对临床医生、特别是全科医生的教育。全科医生（GP）已经参与了订购遗传检测的过程。

LJ：直接面向消费者的检测与床侧遗传检测具有共同点，它们都需要进行遗传咨询，帮助患者和家属了解检测结果。例如，如果进行生殖系检测鉴定出纯合的莱顿第五凝血因子突变，它对患者的影响可能没有对患者的中年吸烟姐妹的影响大。我们是否要进行检测，鉴定此变异，但不告知其他家庭成员他们可能携带该变异以及它对健康的影响？如果某人接受了BRCA检测，我们是否有义务告知其他家属？即使是体细胞变异，我们也在观察生殖系变异，可能会有意外发现。

最主要的困难是我们没有能够在这些情况下向家属和患者提供建议的遗传咨询资源。我们需要在初级医疗层面，对初级医生、医生助理（PA）、注册护士（RN）和高级执业护士（APN）进行更多教育。

SP：BRCA检测是第一个同时具有体细胞和生殖系的主流遗传检测，可以作为范例。但这在临床实践方面是一个问题。在此类检测的临床实施中有太多变化，因此教育真的很重要。我看到很多实验室只进行体细胞突变检测，而完全忘记了生殖系，忘记了发现突变的家庭影响。

LJ：例如，在儿科，约10%–15%的癌症患儿具有生殖系易感变异。这对整个家庭都有影响。不能只对儿童进行遗传检测而不考虑这一点。

总结

NGS一直是全世界分子诊断实验室的重要工具，未来仍将如此。临床医生和病理学家了解单次多基因NGS癌症panel检测在诊断和治疗患者中的潜在价值和优势。可分析的有效性数据、可靠的临床变异数据库、NGS panel检测报销策略、确保临床有效性的最佳实践指南是NGS panel成为全世界常规临床检测的必要条件。