探索肿瘤微环境
单细胞测序在检测肿瘤细胞内通讯方面具有重要价值。
探索肿瘤微环境
简介
为什么有些癌症会转移到远处去浸润器官和组织？为什么某些转移性肿瘤有耐药性？这些问题一直困扰着研究人员。许多人把目光投向了肿瘤细胞本身。但是很显然，这些细胞的内部运作并不能完全解释这些行为。研究人员扩大了研究范围，研究了肿瘤微环境可能发挥的作用。其中含有血管、免疫细胞、成纤维细胞和肿瘤周围的胞外基质。这项研究对于癌细胞如何以及为什么会转移到身体其他部位并产生耐药性这些问题提出了惊人的见解。
Alex Swarbrick副教授（PhD）是澳大利亚悉尼Garvan医学研究所肿瘤进展实验室的负责人。他的研究使用了单细胞RNA测序（scRNA-Seq）等单细胞技术来探索乳腺癌和前列腺癌的肿瘤微环境。其目的是阐明其中的基因表达模式，并确定未来癌症治疗的潜在靶点。
iCommunity采访了Swarbrick博士，了解了单细胞新一代测序（NGS）技术的优势，以及认识肿瘤微环境对于开发更强大的抗癌治疗手段的重要性。
Alex Swarbrick博士是Garvan医学研究所肿瘤进展实验室的负责人。
Q：您是什么时候加入Garvan研究所的？
Alex Swarbrick（AS）：我已经在Garvan研究所工作了12年。我之前是加州大学旧金山分校的博士后。我在Garvan研究所的工作重点是细胞基因组学。我正在利用单细胞方法来了解人类疾病。细胞基因组学令人兴奋的一点是我们可以直接进行人类的基础研究和转化研究。然后我们会使用实验模型来进行逆向工作，帮助我们确定疾病机制。
许多实验室已经意识到，细胞基因组学能为疾病研究提供新的视角，无论是癌症、自身免疫性疾病、免疫学还是神经生物学。Garvan研究所的许多实验室正在进行细胞基因组学研究。该研究所最近还与以色列的Weizmann科学研究所建立了合作关系，共同创建了专注于这一新领域相关研究的Garvan-Weizmann细胞基因组学中心。
Q：肿瘤微环境如何影响疾病？
AS：肿瘤微环境包括组成肿瘤的所有细胞，而不仅仅是恶性细胞。越来越多的人认为，肿瘤内的其他细胞不仅仅是普通组分，而是疾病进展中的积极参与者。从本质上讲，癌症就像一个生态系统。如果我们了解了这个生态系统的所有组成部分，我们就能对它的行为有更深入的理解。这包括癌症形成新的转移病灶的能力及其对治疗的反应。
Q：微环境中的哪些细胞可能在癌症的发生和发展中起作用？
AS：最明显的是微环境中的免疫细胞。很明显，免疫系统从一开始就在癌症的发展过程中发挥了相当重要的作用。在我们的一生中，我们都会通过突变的过程产生异常的细胞。在大多数情况下，免疫系统会识别出这些细胞并将它们消除。在极少数情况下，突变细胞会发展出逃避免疫系统的策略，并发展成癌症。目前有一些对抗这类策略的癌症治疗方法正在开发，还有一些已经投入临床应用，例如靶向PD1、PDL1和CTLA4的“免疫检查点”药物。
微环境中存在其他细胞组分的证据还不太明确，但我们怀疑它们发挥了重要作用。我们对基质细胞（包括成纤维细胞）很感兴趣。这些细胞往往在肿瘤中占了相当大的比例，并且发挥着机械性的作用。例如，成纤维细胞决定了肿瘤的硬度或流动性。但成纤维细胞也会与肿瘤内的其他细胞交流，影响它们的行为。它们会与癌症细胞和免疫细胞交流。
Q：了解成纤维细胞在癌症中的作用将如何促进新治疗方法的开发？
AS：在过去二十年中，人们在实验系统中已经获得了一些喜人的工作成果，这些成果表明成纤维细胞会影响肿瘤对治疗的反应行为。在侵袭性三阴性乳腺癌中，我们发现成纤维细胞会建立了一个微环境来促进恶化和耐药的癌症行为。1如果我们能找到一种方法，用某种小分子抑制剂来靶向这些成纤维细胞，我们就能阻止它们对癌细胞提供支持，不让其将癌细胞变得敏感，这样癌细胞就不能有效地对治疗作出反应。我们在实验模型中成功地实现了这一点，并进行了I期试验来证明这种策略的可行性。这是一个早期的证据，它支持了以成纤维细胞或基质细胞为靶点，可以创造治疗癌症的新武器这一观点。
"从本质上讲，癌症就像一个生态系统。如果我们了解了这个生态系统的所有组成部分，我们就能对它的行为有更深入的理解。"
Q：你们最开始是怎么研究癌症微环境的？
AS：我们使用过一些方法，比如免疫组织化学，我们还使用过流式细胞术来分离肿瘤中的细胞，将它们按种类分装到不同的试管中。然后，我们会对分离出的细胞进行RNA-Seq来了解其生物学特性。这项工作让我们取得了很大的进展，但非常辛苦，而且我们当时在试管中采用的仍然是异质细胞群。
Q：单细胞测序如何帮您区分出肿瘤内不同的细胞类型？
AS：细胞是生命和疾病的基本单位。正如对数百万人进行流行病学研究能使我们了解群体行为一样，在细胞水平上研究生物系统并获得新见解也同样重要。
通过使用单细胞测序，我们不需要再预设我们在癌症微环境中会发现什么，只需进行简单的观察，然后着重研究我们发现的内容。这带来了惊人的新见解，没有它的帮助我们将无从知晓。例如，在乳腺癌研究中，我们发现了一群称为平滑肌细胞的基质细胞，以往我们从未意识到乳腺癌中竟然存在平滑肌细胞（未发表）。在过去的20年间，这些细胞被认为是成纤维细胞，因为它们表达了一些相同的标记。我们从来没有意识到它们是不同的细胞类型。
由于我们正在进行临床研究，所以我们能使用的组织量有限。通常，我们的样本只够进行一次分析。所以，我们花了很多时间，希望能从单个样本中获得尽可能多的信息。我们花了时间来研究可以从单一样本中获取多维数据的多组学方法。例如，我们在NovaSeq 6000系统上进行了scRNA-Seq，获得了每个样本中数千个细胞的完整转录组和靶向的细胞表面蛋白组。我们开发了一种名为组库和基因表达测序（RAGE-Seq）的方法，能够同时对重要的分子（例如淋巴细胞受体）进行全长的单分子测序。2我们还采用了其他实验室开发的方法，例如转录组和表位的细胞标签测序（CITE-Seq），这让我们能同时进行蛋白测定和scRNA-Seq。利用CITE-Seq和NextSeq 500系统，我们可以获得数千个单细胞表面的150种不同蛋白的数据。
"我们花了时间来研究可以从单一样本中获取多维数据的多组学方法。例如，我们在NovaSeq 6000系统上进行了scRNA-Seq，获得了每个样本中数千个细胞的完整转录组和靶向的细胞表面蛋白组。"
Q：如何鉴定不同类型的基质细胞及其在细胞内信号转导中的作用？
AS：我们使用单细胞NGS技术鉴定了癌症不同的基质状态。我们确定了四种不同的基质细胞群，包括肌成纤维细胞、炎性成纤维细胞和两种形式的平滑肌细胞（未发表）。根据它们的基因表达特征，我们可以鉴定它们的细胞类型，预测它们表达的分子类型，并鉴定它们通过什么分子来向邻近的细胞传递信号。
我们目前正在研究一个假设，即乳腺癌患者的基质微环境的性质可能会在一定程度上决定免疫系统是否有能力消灭肿瘤细胞。我们之前发现的证据表明成纤维细胞能向癌细胞发出信号，使其更具侵袭性。我们还发现了一些证据，证明肿瘤微环境中的成纤维细胞会向CD8+T淋巴细胞（免疫系统的杀伤细胞）发出信号，并分泌分子来降低T细胞对癌细胞的杀伤力（未发表）。这一信号可以在某种程度上解释为什么目前的乳腺癌免疫疗法常常不起作用。
我们正在使用实验系统来测试阻断这种信号是否能在乳腺癌中增强抗肿瘤免疫力。我可以想象这样一种场景，未来的某一天，患者可能会同时接受免疫疗法和一种阻断基质微环境抑制信息的药物。
Q：转录特性如何揭示瘤内异质性？
AS：肿瘤内的所有细胞类型都存在多样性，包括癌细胞。然而，这种异质性的驱动因素仍然难以捉摸。我们已经开始使用scRNA-Seq来研究这种异质性。内分泌疗法（例如他莫昔芬和芳香化酶抑制剂）已经取得了巨大的成功，挽救了数十万人的生命。然而许多女性接受了这些药物治疗后有复发的情况。我们并不了解每个病例复发的性质。它有时是由雌激素受体的突变引起的，有很多研究人员正在研究该领域。在其他病例中，它也可能是由接受治疗的细胞群内的异质性导致的。还有可能存在不依赖内分泌的细胞群，这也许能解释为什么内分泌疗法对女性的治疗效果不佳。
"从某种程度上来说，Illumina系统已经融入到了我们的研究中，我们已经习惯了它们的存在。我们会获得数据，也知道数据很好，然后就继续进行下一步。Illumina系统的表现非常好。"
雌激素受体是一种转录因子，它的活性可以很容易地通过单细胞基因组技术（例如scRNA-Seq）来测量，进而评估不同的细胞群并确定对内分泌疗法耐受的细胞群。希望我们将来能发现这群细胞的弱点，消灭它们。这项研究最终可能会推动联合疗法的发展，为复发风险较大的女性带来福音。
Q：Illumina NGS系统在你们的研究中表现如何？
AS：我们使用Illumina NGS系统来满足我们所有的高通量测序需求。我们正在使用珍贵的临床样本来进行转化研究，因此我们需要的技术平台必须拥有可靠、稳定、高质量的试剂。从某种程度上来说，Illumina系统已经融入到了我们的研究中，我们已经习惯了它们的存在。我们会获得数据，也知道数据很好，然后就继续进行下一步。Illumina系统的表现非常好。在早期，我们使用的是NextSeq 500系统。我们的单细胞测序合作伙伴，新南威尔士大学的Ramaciotti基因组学中心购买了一台具有大容量测序能力的NovaSeq 6000系统，因此我们在2019年初就开始使用它了。我们和同事一起批量处理样本并进行测序，这能够让我们从规模经济中受益。它降低了我们的测序成本，并且我们的数据和以前一样好。
Q：您研究的下一步计划是怎样的？
AS：我们将进行更多的细胞基因组学研究，填补我们对一些常见癌症的认知空白。在前列腺癌方面，我们正在进行早期局部疾病和转移性疾病的研究。前列腺癌本身就具有一定的异质性。前列腺癌的组织病理学非常复杂，因此研究前列腺癌的病理学家通常需要集中精力来专门研究这种疾病。患者的前列腺内通常具有多个癌灶，并且这些癌灶周围存在动态的基质重构。这是一个令人兴奋的研究领域，通过从纯粹的形态学研究转向更深入的遗传学研究，我们能获得很多东西。我们投入了大量精力来寻找过滤NGS结果的正确方法，然后再返回实验系统中去检验它们的相关性。通过这种方法，我们不但可以观察某种现象，还能了解某些事物在机制上或治疗上的重要作用。
Q：您怎么看癌症研究领域NGS测序应用的发展趋势？
AS：我认为其中一个趋势是空间RNA分析及其相关技术。目前，大部分单细胞基因组学研究都是从制备细胞悬浮液开始的。因此我们会丢失这些细胞的空间、形态和位置信息。
而新技术能让我们在组织中进行细胞分辨率的测序研究。通过这种方式，我们可以维持细胞的形态以及它们与其他细胞之间的空间关系信息，这对鉴定和演示细胞间的信号转导至关重要。这太令人兴奋了，我很期待我们能通过新技术获得什么。
查看有关Garvan研究所开展的测序项目的更多信息：
深入了解本文提及的系统：
NovaSeq 6000系统，www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
NextSeq 500系统，www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/nextseq.html
参考文献
- Cazet AS, Hui MN, Elsworth BL, et al.Targeting stromal remodeling and cancer stem cell plasticity overcomes chemoresistance in triple negative breast cancer.Nat Commun.2018;9:2897. doi: 1038/s41467-05220-6.
- Singh M, Al-Eryani G, Carswell S, et al.High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes.Nat Commun.2019;10(1):3120. doi: 10.1038/s41467-019-11049-4.