利用NGS研究罕见未确诊遗传病

简介

罕见病只影响一小部分人。但这个“小”是相对的。在美国，国家转化科学推进中心将罕见病定义为患者人数不超过200,000人的疾病。¹在欧洲，患病率低于1/2000的疾病被认为是罕见病。²在韩国，韩国未确诊疾病项目（KUDP）将患者人数不到20,000人的疾病，或由于其罕见性导致患病率未知的疾病定义为罕见病。³将所有这罕见病患者群体的人数加起来，其数量并不“小”。目前已知的罕见病多达7000种，还有许多尚未被发现，全世界有数千万人受到影响。不幸的是，由于缺乏可靠、准确的临床工具，他们中的许多人可能无法得到诊断和治疗。Murim Choi博士正在努力改变其中一些患者的未来。

Choi博士是首尔大学（SNU）医学院的副教授，他与当地临床医生密切合作，共同研究儿童神经发育障碍。Choi博士是SNU医学院功能基因组学实验室的首席研究员，为KUDP的许多研究工作做出了贡献，他的目标是利用新一代测序（NGS）和其他形式的遗传分析来了解各种人类疾病的分子机制。他是使用全外显子组测序（WES）来鉴定可能导致不同罕见病的遗传变异的先驱。在其职业生涯早期，他自学了Perl编程语言来增强自己理解研究生成的数据的能力。最终，Choi博士的目标是帮助诊断那些常常表现出奇怪症状的罕见病患者。

iCommunity采访了Choi博士，了解了他对Perl编程的热爱、他过去十年中使用WES的情况以及未来罕见病研究中NGS的应用。

Murim Choi博士是SNU的副教授，SNU医学院功能基因组学实验室的首席研究员，还为KUDP的研究做出了贡献。

Q：是什么激发了您对遗传学研究事业的兴趣？

Murim Choi（MC）：我最初学习的是发育生物学，获得了分子生物学学士学位。我之前一直想研究心脏的发育，并最终在杜克大学研究了小鼠系统的心脏发育。这不是基因组学研究，更多是胚胎学和小鼠遗传学的研究。2000年初的时候，我正在研究由一个遗传变异造成的表型变异，它在一种特定的小鼠品系中造成了心脏问题。正是这个项目将我带入了遗传学的世界，开始了解了基因型与表型的关联。从那以后，我就决定我要研究人类遗传学。

Q：您从什么时候开始研究人类疾病的遗传学机制？

MC：2007年，我开始在耶鲁大学Richard Lifton博士的实验室工作。我们会使用Illumina SNP芯片来分析疾病基因组的基因型、杂合性和拷贝数变异（CNV），也会进行全基因组关联研究（GWAS）。这对我来说完全是一个全新的世界。

"现在，NGS的成本已经显著下降，我们通常将WES作为评估罕见遗传病的第一步。"

Q：是什么促使您自学Perl编程语言？

MC：我发现我需要学习编程，以便管理我们在Lifton博士的实验室生成的数据。我带着1岁的儿子到书店买了一本关于Perl的书，那时候Perl是生物信息学领域的主要工具。我白天在实验室制备DNA并进行GWAS，晚上在儿子睡觉后开始学习Perl。我非常喜欢这个工具。

当时还没有公共的GWAS数据分析工具，因此我用我的Perl知识设计了基因组改变和下游分析。我向Lifton博士展示了我研究的队列的GWAS数据，他很喜欢这种分析方法。他说我不应该回到实验台做实验，而是建议我掌握分析和管理遗传数据的技能，我很赞同他的观点。能够消化和理解数据让我感觉自己很强大。

Q：Lifton博士的实验室以研究心血管疾病而闻名。您为何会参与到罕见遗传病和未确诊遗传病的研究当中呢？

MC：我在Lifton博士实验室的工作能让我以非常广泛的方式分析一个人的基因组。他非常亲切，为我提供了他拥有的所有数据集进行分析。2009年引入第一台NGS系统时，Lifton博士让我建立实验室的WES流程。最早的项目之一是使用NGS对一位确诊的罕见病患者进行外显子组测序。

Q：为什么有些罕见病如此难以诊断？

MC：大部分罕见病是孟德尔遗传的单基因疾病。它们的症状可能多样而复杂的，并且会在发育早期发病。这些特征使得临床医生很难对其进行诊断。因此，患者生活的地区和临床医生的经验对于罕见病的诊断非常重要。如果是简单且明确的罕见病，患者在家附近的诊所就可以立即得到诊断。但不是所有医生都有足够的罕见病诊断经验，这增加了他们误诊的可能性。在韩国，当地的儿科医生可能会将这些患者转诊给SNU儿童医院的临床医生。我隶属于这家医院，它就在我实验室的街对面。我的实验室坐落在研究这些疾病的绝佳地点。

"……我们的研究小组正在进行更多的功能性基因组技术，包括CRISPR和基于单细胞的NGS分析。"

Q：遗传评估能为儿童罕见病患者提供什么？

MC：即使进行了遗传评估，我们也不是总能找到治疗罕见病的方法。如果它是一个新发突变，我们可以让父母知道后面的孩子不大可能受该疾病影响。如果疾病是隐性变异造成的，我们可以建议父母在生第二个孩子之前对突变进行预筛查。

有时，我们能为孩子和家庭提供直接的帮助。一种情形是鉴定出代谢途径中的酶发生了突变，导致缺乏一种重要的代谢物。在这种情况下，我们可以补充这些代谢物来减轻症状。

另一种情形是我们鉴定出了变异，但已经有用于非罕见病的、靶向这些变异的药物。例如，在几年前的2个案例中，我们分别鉴定了在自身免疫和高炎症反应的关键基因中携带新发突变的患者。一种功能类似的抗体可以增强缺陷基因的功能，减轻了其中一名患者严重的自身免疫系统反应。⁴一种信号转导抑制剂能减弱已经增强的基因功能，这种药物也缓解了另一名患者的血管病变。⁵

但是，我们分析的大部分患者是儿童神经疾病患者，他们的病情很复杂。神经系统疾病是最需要在理解遗传学原理方面取得突破的疾病。

Q：与之前的遗传技术相比，NGS技术在鉴定罕见病相关变异方面有什么优势？

MC：刚加入Lifton实验室时，我还很年轻，不知道NGS能提供什么。我有听到人们在谈论测序如何变得越来越强大，可我并不清楚这些话的含义。我当时唯一知道的测序方法是桑格测序，我不明白让测序变得更快会带来什么优势。

但我很快意识到NGS的速度要快得多，并且提供了最佳的基因组覆盖范围。然而，当我刚开始在SNU与临床医生合作时，由于NGS的成本较高，我们通常会很谨慎，不会立即使用NGS。我们会从桑格测序开始，或者专注于基于临床解读的筛选方法。如果它们不能提供答案，我们会转向WES，这种方法能为未知基因提供更大的覆盖范围，可以鉴定意料之外的基因突变，为新的综合征和未被识别的疾病提供解释。

现在，NGS的成本已经显著下降，我们通常将WES作为评估罕见遗传病的第一步。如今NGS的成本已不再高昂，我们可以使用NGS对每个罕见病患者进行重测序，更好地了解其病症的遗传学机制。它可以让我们按照此前未知的基因型对患者进行分类。我认为NGS在罕见病研究中的应用会越来越多。

"过去十年，Illumina的测序数据变得越来越好。我们有质控流程，但数据一直很稳定，因此该质控流程也很少发出警示。"

Q：NGS如何为你们的研究提供助力？

MC：我们实验室进行了两种NGS研究；患者基因组测序，例如全基因组测序（WGS）和WES，以及功能基因组学。两种研究都充分利用了NGS技术。功能基因组学研究会评估未知重要性的变异对细胞功能的影响。我们会长期关注罕见病患者的情况，因此，我们可以利用这些信息。它为我们提供了非常全面的解读。

Q：是什么促使你们开始在研究中使用WES？

MC：我们在Lifton博士的实验室使用WES分析了6个受试者样本，这些样本都没有已知的突变，其中5个样本来自近亲婚姻受孕的患者。当时，在这些个体中检测纯合变异要容易得多。5位患者中有1位被诊断为患有Bartter综合征。我们没有找到与Bartter综合征相关的突变，但鉴定出了一个氯通道基因的突变。我们与一位博士后讨论了这些发现，她很了解Bartter综合征这种肾脏疾病的生物学知识。她认为导致患者出现症状的病因是与先天性失氯性腹泻相关的氯通道破坏，而不是Bartter综合征。幸运的是，先天性失氯性腹泻有相应的治疗药物，它减轻了受试者的症状。这是第一个证明NGS技术能为罕见病患者的诊断提供信息的研究。⁶

Q：你们的研究中对WES的使用是怎样变化的？

MC：自从我们报道WES可用于帮助诊断罕见病以来，已经有10年了。我们使用WES鉴定了SPONASTRIME发育障碍中的TONSL突变、⁷GM1神经节苷脂沉积症中的GLBI突变⁸和Rett综合征中的GABBR2突变。⁹WES的价值已不再是秘密，现在正逐渐成为相关行业和诊所的常规应用。我们合作的儿科临床实验室现在已经将WES作为了常规检测手段。他们发现了有意思的结果后会交给我们，由我们来继续进行深入研究。

WES是一种非常稳定的技术。然而，作为基础科学家，我们认为WES应当由临床实验室完成。因此我们的研究小组正在进行更多的功能性基因组技术，包括基于CRISPR（规律成簇间隔短回文重复序列）的筛选方法和基于单细胞的NGS分析。虽然我们的方法有所改变，但我们的目标却从未改变。我们对于理解表型与基因型的关联仍然很感兴趣。我们正在利用功能基因组学数据来理解患者的表型数据，从而鉴定是否存在罕见病。

"我认为我们将看到更多临床实验室对罕见病患者的样本进行WES。WGS在临床上也会有一席之地。"

Q：SNU医学院功能基因组学实验室的研究重点是什么？

MC：我们实验室专注于超级罕见病的遗传学机制。我们有大量的研究对象，并且在新的基因型与表型的关联方面发现了一些有趣的东西。我们使用这些信息与GeneMatcher进行了合作，GeneMatcher是一个能与全世界临床医生和研究人员分享基因和表型信息的平台。它为我们提供了一个窗口来了解细胞内真实发生的生物学过程，能让我们确定新发现的基因能否成为潜在的治疗靶点。

我们也在进行数据分析研究。我们大约已经积累了700个先证者及其父母的数据。虽然与英国和主要联盟正在进行的大型数据项目相比，这只是一个很小的研究，但在建立数据库时，我们可以使用这些数据来进行控制和比较。

正如我之前说过的，韩国没有近亲婚姻，纯合变异也很少。但我们复合杂合变异的发生率较高。我们相信，如果我们能增加数据库中先证者家庭的数量，我们将拥有创建预筛查罕见病潜在父母和相关突变的基因panel所需的信息。随着NGS价格的降低，检测的费用也会越来越便宜，想要孩子的夫妻也能负担得起。

Q：你们使用哪些NGS测序系统？

MC：我们在Lifton博士的实验室建立WES流程时使用了HiSeq 2000系统。在我们的功能基因组学实验室，我们将测序外包给了服务实验室，它使用HiSeq和NovaSeq 6000系统。过去十年，Illumina的测序数据变得越来越好。我们有质控流程，但数据一直很稳定，因此该质控流程也很少发出警示。

Q：您的研究团队如何向KUDP贡献自己的力量？

MC：Jong-Hee Chae博士是一名儿科医生，也是KUDP的首席研究员，她是我最紧密的合作伙伴之一。她负责KUDP儿童神经学项目，创建了具有5000个神经发育队列的数据库。最近，我们成功地将WES流程迁移到了她的实验室。我参与了对发现的不同变异的遗传解读工作，还参加了审查分析的临床医生会议。

Q：您如何看待NGS在罕见病和未确诊遗传病研究领域的未来？

MC：我认为NGS的使用将在未来持续增长。临床实验室与基础科学实验室使用的方法将有更多的不同。

我认为我们将看到更多临床实验室对罕见病患者的样本进行WES。WGS在临床上也会有一席之地。人们可以使用WGS来进行连锁分析研究，缩小研究的区域。组织样本的RNA-Seq也能用于研究目标基因。我相信WGS最终将在韩国的临床实验室中成为常规的应用。

在研究罕见病的基础科学实验室中，如果我们对在基因组中寻找的对象有明确的假设，我们将继续进行RNA-Seq。我们也会使用CRISPR和其他合成引物来进行更多的功能基因组学筛选，以便最终将我们的发现与患者的表型信息进行比较。