靶向重测序可实现高通量的体细胞嵌合检测
Saumya Jamuar博士在第一个系统性的高通量方法中利用靶向重测序来鉴定脑畸形中的罕见嵌合突变。
靶向重测序可实现高通量的体细胞嵌合检测
简介
体细胞突变是癌症的特征之一，它会导致形成两个或更多具有不同基因型的细胞群。然而，虽然体细胞突变在遗传性疾病中的作用已经得到了重视，但它们在神经发育疾病中的发生率直到最近才得到系统性的评估。
在以前，遗传变异用毛细管电泳（CE）或桑格测序鉴定。但这一反复的过程费时费力，并且检测范围有限，无法识别罕见变异。1而新一代测序（NGS）等新技术能让科学家扩大研究范围，缩短发现路径。
Saumya Jamuar（医学博士）是新加坡KK妇女儿童医院的临床遗传学家，也是Global Gene公司（一家创新的基因组学研究和开发公司）的联合创始人，他创建了第一个系统性的高通量方法来鉴定与大脑皮层畸形相关的体细胞突变。2借助MiSeq系统和TruSeq Custom Amplicon Assay，他采用了NGS来开展这项研究。
iCommunity采访了Jamuar博士，了解了其靶向重测序panel的开发，以及他如何使用NGS来改善人类健康。
Q：您为什么成为了一名医生？
Saumya Jamuar（SJ）：医学这种职业可以让人们在他人最脆弱的时候，以一种非常直接的方式来改变他们的生活。作为一名儿科医生，我时常觉得帮助孩子不是一件容易的事，但在咨询结束时听到的“谢谢”让我很有满足感，尤其是在他们确实有所好转的时候。这种喜悦和对工作的满足感不断激励着我的整个职业生涯。
Q：是什么促使您在行医之余，还从事科学研究？
SJ：我在新加坡学习并完成了儿科住院医生实习，随后在哈佛医学院获得了政府资助的遗传学奖学金。完成这一段学业后，我继续留在了哈佛，在Christopher Walsh博士的实验室开展博士后的研究工作。在那里，我从一名临床医生转变成了一名临床科学家。我意识到在诊所的时候，我一次只能帮助一名患者。而在实验室里，我可以通过科学研究来改善人类健康，进而帮助更多的患者。
我看到转化研究领域仍然存在大片的空白。转化研究的发展速度跟不上基础科学研究或临床试验的发展速度，基础科学研究在患者护理方面的应用也很匮乏。我的临床医学背景和在Walsh实验室获得的基础研究能力为我提供了投身转化医学研究的绝佳机会。我也是从那时开始了解Illumina的。
“我意识到在诊所的时候，我一次只能帮助一名患者……我可以通过科学研究来改善人类健康，进而帮助更多的患者。”
Q：您在Walsh实验室做了哪些类型的研究？
SJ：我一直对神经系统疾病很感兴趣，尤其是大脑发育过程以及该过程中的差错如何引起脑畸形。Walsh教授是一位神经学家，同时也是脑畸形和神经精神疾病遗传学领域的领军人物，因此Walsh实验室对我来说非常完美。我的研究项目旨在开发一种系统性的方法来研究脑畸形中的体细胞突变。
Q：Walsh实验室那时有在用Illumina的系统和产品吗？
SJ：实验室当时还没有购买Illumina系统。他们那时的测序工作是在核心实验室或服务实验室进行的。他们会将测序样本寄给不同的供应商，而其中一些有使用Illumina的技术。在开展项目的背景工作时，我查阅了各种产品信息，在2012年，市面上的产品包括Illumina TruSeq Custom Amplicon、Agilent HaloPlex和Ion Torrent扩增子测序等。这三个产品都在我的考虑范围内，经过深思熟虑，我决定采用TruSeq Custom Amplicon。
Q：您为什么选择了TruSeq Custom Amplicon？
SJ：原因之一其实验设计和panel的定制相对容易。当我用DesignStudio软件测试TruSeq Custom Amplicon时，整个过程非常简单。我只需要输入基因名称，然后指定我需要的外显子-内含子边界的侧翼长度。两天后，我就能得到一份可以满足我大部分需求的设计了。随后，只需几个额外的步骤即可优化panel，这个过程也相当简单。
第二个原因是Illumina技术的声誉。在与熟知不同技术的人交流时，他们建议我使用Illumina技术，因为它的数据质量稳定可靠。最后，它确实表现优异。
“他们建议我使用Illumina技术，因为它的数据质量稳定可靠。最后，它确实表现优异。”
Q：在NGS出现之前，您应该用过桑格测序来进行研究。桑格测序当时在变异检测中鉴定突变的优势是什么？
SJ：事实上，利用桑格测序来检测变异并没有多少优势。这是一个漫长的过程，因为桑格测序需要一个一个地检测基因。有时，实验室会对许多基因进行测序，但却得不到任何有用的结果。借助NGS，我们可以把所有感兴趣的基因放在同一个panel、同一个反应中，然后就只需要等待结果了。
另外，桑格测序对嵌合变异的检测限大约为15–20%。当我们试图检测嵌合变异时，我们发现这些变异的比例可以低至5%，桑格测序无法检测这些变异。2而使用TruSeq Custom Amplicon，我们可以轻易地检测出嵌合变异，根据校准样本，我们能达到1%的理论检测限。2与桑格测序相比，这是一个相对简单的过程。十多年来，研究人员一直在尝试系统地检测嵌合变异。借助TruSeq Custom Amplicon panel和MiSeq Reporter软件，我能在一周内鉴定这些嵌合变异。NGS实现了一个高效的嵌合变异检测过程。
然而验证这些嵌合变异需要更长的时间。我们必须证明变异是真实的，而不是测序错误。我们采用了桑格法对亚克隆（单个克隆）进行测序来证明这一点，这需要再花6个月的时间才能完成。低频变异的验证仍然是一个问题，各个实验室正在寻找替代性方法来验证低于30%的变异。
Q：为什么您特别关注体细胞嵌合与脑畸形？
SJ：Walsh实验室在编码双皮质素的基因DCX中发现了嵌合变异，它会导致双皮层（DC）综合征和X连锁无脑回畸形（XLIS），即一种“平滑大脑”型畸形。3患有无脑回畸形的儿童通常神经受损；他们可能还患有癫痫、发育迟缓、进食问题和吸入性肺炎。
脑畸形很容易通过MRI等结构成像来鉴别。可以直接观察到无脑回畸形大脑缺乏脑沟（沟）和脑回（脊）。但DC是一种谱系疾病；有些人患有癫痫，但行为表现很正常。他们并没有发育迟缓。MRI会显示一些类似无脑回畸形的改变，但并不完全。这是由神经元的细胞自主性造成的。没有突变的神经元将按照预期的方式进行生长和迁移，并形成正常的大脑皮层。带有DCX突变的神经元将出现迁移缺陷，它们会在正常皮层的下方形成神经元异位带，因此被称为“双皮层”。虽然放射学结果可以轻易发现大脑中的嵌合，但问题仍然存在。它有多严重？在借助影像学检查确定了脑畸形的家庭中，有多少家庭有嵌合变异而桑格测序却没有发现？
“使用TruSeq Custom Amplicon，我们可以轻易地检测出嵌合变异，达到1%的理论检测限……NGS实现了一个高效的嵌合变异检测过程。”
Q：您如何使用TruSeq Custom Amplicon来检测那些桑格测序未检出的结果？
SJ：桑格测序遗会漏掉一些比例低于检测限的嵌合变异。有一名患者接受了全外显子组测序，但由于测序的覆盖度水平非常低，这次检测依然漏掉了嵌合变异。TruSeq Custom Amplicon能对指定基因组区域进行深度测序，其覆盖深度至少能达到200–500倍，并且还可以靶向与脑畸形相关的基因。
Q：靶向应用是否已经用于其他的神经发育障碍？
SJ：Walsh及其他实验室已经利用了靶向测序来检测自闭症等其他神经发育障碍中的体细胞突变。4
Q：其他实验室是否在利用NGS来检测各种神经疾病中的体细胞突变？
SJ：最近有一项研究利用全基因组测序来检测了引起严重智力障碍的变异。5还有一些文章也利用NGS来揭示了癫痫中的体细胞突变。
Q：如此看来，您的研究为探索体细胞突变在这些疾病中的作用打开了一扇新的大门？
SJ：我们明确地展示了，在检测体细胞突变上，NGS是比桑格测序更好的选择。我们在8名受试者中发现了体细胞突变，值得注意的是，传统的桑格测序几乎遗漏了三分之二的突变。其中一名受试者为了寻找答案，又接受了全外显子组测序。但事实是必须进行深度测序，才能找到嵌合突变。
必须强调的是，我们并不是第一个使用NGS来检测体细胞突变的实验室。曾有个别病例报道，研究人员进行了全外显子组测序并且发现了体细胞突变。不过，我们开发出了第一个用于鉴定体细胞突变的系统性高通量方法。现在，一些临床实验室也已经开始利用深度靶向测序来寻找体细胞突变。
“MiSeq Reporter能让我检测出其他方式无法检测的突变，这不是因为数据不好，而是因为我没有使用适当的比对工具。”
Q：您为什么选择MiSeq系统？
SJ：我主要考虑了MiSeq和HiSeq系统，HiSeq 2000系统的周转时间为14天。我想尽快知道我的实验设计是否有问题，因此选择了MiSeq系统，它能在40小时内给我答案。将文库上样到系统中，第二天就能获得结果。
而现在的HiSeq 4000系统的周转时间是1–3天，这是一个可以提供更高通量的选项。它可以让研究人员运行更多的样本。
Q：MiSeq Reporter软件对您的研究有何帮助？
SJ：刚接触NGS时，我就知道Illumina开发了非常出色的测序化学技术和检测panel，但那时我对生物信息学的能力还没有什么信心。在使用MiSeq Reporter后，一切都变了。我曾使用过不同的算法和流程来进行生物信息学分析，但都没有得到想要的答案。我决定试试MiSeq Reporter，我发现这个过程很快，而且最后我成功获得了想要的结果。
从DNA到报告的解决方案确实很有用。在测序仪上运行测序panel只是第一步。生物信息学很重要，也很有挑战性。使用MiSeq Reporter的诀窍在于它可以对目标区域进行局部比对。我试过自己比对FASTQ文件，但我把文件与整个基因组进行了比对。对于大基因，比如编码细丝蛋白A的FLNA基因，我只获得了50%的比对结果，这是因为许多read的定位有误，故而被丢弃了。在使用MiSeq Reporter软件处理相同的数据后，我的比对从50%一下子提高到90%。MiSeq Reporter能让我检测出其他方式无法检测的突变，这不是因为数据不好，而是因为我没有使用适当的比对工具。
“NGS改变了我的行医方式。它可以帮我向患者的父母解释，他们的孩子之所以有这些问题，是因为患有遗传病，我能鉴定出突变并给他们一个更精确的答案。
Q：如今您又回到了新加坡KK妇女儿童医院（KKH），您是否仍然会使用Illumina的NGS系统来进行现在的研究？
SJ：回到新加坡之后，我成为了KKH未确诊疾病项目的临床主管。我们目前正在使用HiSeq 4000系统来进行这些受试者的全外显子组测序。对于综合征患者，我们会在MiSeq系统上使用TruSight Inherited Disease Sequencing Panel进行检测，以此作为鉴定已知基因突变的第一步。如果检测结果为阴性，我们会继续进行全外显子组或全基因组测序，全基因组测序会在HiSeq X Ten系统上进行。
Q：在您来KKH之前，这里就已经拥有这些Illumina系统了吗，还是您影响了他们的采购决策？
SJ：我们不拥有任何HiSeq系统，我们使用的是合作者的仪器。不过我有鼓励我们的研究实验室购买MiSeq系统，它带给我的体验很好。
Q：Global Gene公司是一家怎样的公司？
SJ：在波士顿的时候，我与一位哈佛的同事Jonathan Picker教授共同创立了Global Gene公司。我们的目标是利用基因组学来了解那些尚未充分研究的群体，为亚洲市场（例如印度、中国和中东）供应经济有效的基因组解决方案，进而打破传统的医疗保健体系，为这些经济体提供精准医疗。
Q：您在Global Gene公司中负责解决哪方面的问题？
SJ：为了从精准医疗和基因组学的进展中受益，我们需要将基因组学数据与临床背景联系起来，然后创建相关应用来惠及终端患者。美国和欧洲有许多精准医疗领域的专家，但南亚、东南亚和中东却落后于世界其他地区。这导致了科学文献中60%以上的数据来自于不到1%的全球人口。例如印度有13亿人口，但公开的全基因组序列却不到100个。尽管千人基因组计划（1KGP）中有一些印度人代表，但他们都来自印度人群中的特定亚群，包括古吉拉特人、旁遮普人和锡克人，只能代表4或5个不同的亚群。有研究表明，印度人不同于欧洲人和白人，但根据主成分分析，来自印度不同地区的个体倾向于隔离。
Global Gene公司以及我们的合作者正在为亚洲的精准医疗构建基础，我们从印度开始，通过定制应用将基因组学带到这些市场。
“事实上，利用桑格测序来检测变异并没有多少优势。这是一个漫长的过程……借助NGS，我们可以把所有感兴趣的基因放在同一个panel、同一个反应中，然后就只需要等待结果了。”
Q：这是一项开拓性的工作，你们如何实现它？
SJ：Global Gene公司致力于利用基因组学，以积极的方式来改善每个人的生活。这意味着我们将针对特定群体创建相关的定制应用，以节省疾病的情感成本和经济成本。
例如，印度每年大约会新增100万名癌症患者，在2015年估计有70万人死亡。对于某些类型的癌症，例如乳腺癌和卵巢癌，每年新发现的病例有15万之多。美国的5年存活率为89%，而印度只有52%，并且研究表明肿瘤药物的疗效不佳。我们正与英国的伙伴合作，在印度启动个性化化疗——结合表型-基因型和药物相互作用的信息，为每个个体制定最有效的治疗计划。我们将凭借我们在基因组学方面的专业知识以及与这些人群的接触，大力支持制药公司，帮助他们为其目标人群开发更好的个性化创新药物。
Q：为什么经济实惠是重点关注的领域？
SJ：我在印度长大，很熟悉以一种经济实惠的方式提供产品将面临的挑战和机遇。在Global Gene公司关注的市场中，尽管有很多患者可以负担任何价格，但负担能力的金字塔意味着治疗费用越实惠，能够从这一激动人心的技术中获益的人数就越多。因此，其中一个关键问题就是如何通过供应链让产品更加经济实惠，这也是我们的核心理念。最终，我们的目标是在科学应用中进行创新，开发个性化产品，并在成本结构的效率上实现创新，尽可能让更多人受益。
“我们的目标是利用基因组学来了解那些尚未充分研究的群体，为亚洲市场供应经济有效的基因组解决方案……”
Q：在您从医期间，NGS对医学有何影响？
SJ：NGS改变了我的行医方式。它可以帮我向患者的父母解释，他们的孩子之所以有这些问题，是因为患有遗传病，我能鉴定出突变并给他们一个更精确的答案。更重要的是，我能告诉他们未来是否有再次出现这种情况的风险。即使有一定的风险，由于我们了解这个突变，我们也有办法在怀孕过程中指导他们。在NGS出现之前，我们做不到这些。有一个词叫“生育停止”，指家庭在有了一个患病孩子后决定不再要孩子。如果这是一种未找到分子病因的遗传性疾病，则这种情况还会增加。分子诊断可以改变这一切，现在我能够告诉那些父母，我们可以帮助他们。
Q：您对NGS未来的应用有什么看法？在未来，NGS将如何影响医学？
SJ：我认为，在未来回顾过往时会发现，本世纪最大的成就将与向内观察“人类”以及了解人体如何运作有关。我相信，基因组学是我们有生之年的一项颠覆性“技术”，它能让我们观察自身，并将零散的信息聚集起来。
在过去，临床遗传学主要涉及鉴定潜在的综合征，以及以预期的方式处理并发症。有了NGS，我们能够更深入地鉴定致病突变，在未来我们或许还能修正突变，让人们更健康地生活。
我认为CRISPR等工具及其他相关的基因组编辑技术将会有更高的价值和实用性。地中海贫血是东南亚地区一种常见的遗传性疾病，该地区的人群中有3%是球蛋白基因突变的携带者。我认为在不远的将来，我们将会利用基因组编辑工具彻底治愈这种单基因病。显然，这在未来才能实现，目前CRISPR技术仍在发展中。如果研究人员能够优化CRISPR或其他的基因组编辑技术，就有可能改变医学。这将是NGS从根本上改变临床遗传学实践的方式，这也激励着我。
“十多年来，研究人员一直在尝试系统地检测嵌合变异。借助TruSeq Custom Amplicon panel和MiSeq Reporter软件，我能在一周内鉴定这些嵌合变异。”
Q：您下一步的工作计划是什么？
SJ：在Global Gene公司，我们的计划是了解如何建立这些基因组队列，为药物开发和相关疗法鉴定出潜在的新通路、新靶点。我们的长期计划是在个体水平上实现个性化医疗，而不是像现在这样，将一个解决方案用于所有人。我们希望能为每个人定制专属方案。
Q：与帮助一个人相比，帮助许多人的感觉如何？
SJ：当我以一名医生的身份帮助患者时，我常常在想，如果是一名科学家的话，能够做些什么。科学能让我帮助更多的人，甚至有可能是全球的人。其中一些功劳属于Illumina，它制造出了NGS系统，让我们可以轻松开展这类研究。当你获得结果时，科学会变得更加有趣，当您对患者产生积极的影响时，它会带来更大的满足感。
深入了解本文提及的产品、系统和应用：
TruSeq Custom Amplicon Panel, www.illumina.com/products/truseq_custom_amplicon.html
MiSeq系统，www.illumina.com/systems/miseq.html
靶向重测序，www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/targeted-resequencing.html
参考文献
- Gajecka M. Unrevealed mosaicism in the next-generation sequencing era.Mol Genet Genomics.2016;29(2):513-530.
- Jamuar S, Lam AN, Kircher M, et al.Somatic Mutations in Cerebral Cortical Malformations.N Engl J Med.2014;371(21):2038.
- Gleeson JG, Minnerath S, Kuzniecky RI, et al.Somatic and Germline Mosaic Mutations in the doublecortin Gene are Associated with Variable Phenotypes.Am J Hum Genet.2000;67:574–581.
- D’Gama AM, Pochareddy S, Li M, et al.Targeted DNA Sequencing from Autism Spectrum Disorder Brains Implicates Multiple Genetic Mechanisms.Neuron.2015;88(5):910–917.
- Gilissen C, Hehir-Kwa JY, Thung DT, et al.Genome sequencing identifies major causes of severe intellectual disability.Nature.2014;511(7509):344–347.