乘浪前进：内分泌学家对NGS技术的看法

简介

大约每30,000人中就有1人患有多发性内分泌肿瘤（MEN）。¹这种罕见的遗传综合征至少涉及两个内分泌腺中的肿瘤（良性或恶性）。如果癌变，可能会危及生命。研究人员在了解该疾病和其他遗传性内分泌肿瘤综合征的遗传学机制方面已经取得了长足的进步。在过去的五年中，诸如MiSeq系统之类的新一代测序（NGS）系统让临床研究人员能够对每个样本进行20–30个基因的多重测序，从而发现众多候选基因。

NGS技术推动了Rory Clifton-Bligh（医学和外科学士、博士）的研究，他在剑桥大学攻读博士学位期间就开始研究甲状腺生长和功能的分子机制。除了要参与繁忙的临床实践之外，Clifton-Bligh博士还是悉尼大学的医学副教授。他的研究团队正在使用MiSeq系统来了解内分泌肿瘤的遗传学和代谢性骨病的机制。Clifton-Bligh博士说，到目前为止，他们“已经发现的结果比仅用传统方法所能发现的结果要多得多”。

iCommunity采访了Clifton-Bligh博士，了解了他的团队如何借助Illumina技术来发现遗传性内分泌疾病的致病变异以及潜在的诊断和药物作用靶点。

Q：你们实验室的研究目标是什么？

Rory Clifton-Bligh（RCB）：我们的主要研究目标是了解神经内分泌癌的遗传学生理基础。这涉及遗传性癌症和遗传性肿瘤综合征，包括多发性内分泌肿瘤1型和2型（MEN1和MEN2）、遗传性副神经节瘤-嗜铬细胞瘤综合征（PGL/PCC）和某些遗传性垂体疾病。我们的实验室还研究了非遗传性肿瘤的生物学机制，例如甲状腺癌和肾上腺癌。我们是Kolling医学研究所癌症部门的一部分，在这里，我们可以使用大量的散发性和家族性内分泌肿瘤样本，这些样本已经保存了数十年，且带有合理的临床注释。

Q：通过研究内分泌疾病的遗传基础，你们能了解到什么？

RCB：研究内分泌疾病的遗传基础能让我们从最基本的层面了解这些肿瘤的基因组异常。例如，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤虽然相对少见，但却是已知的遗传性最高的肿瘤。事实上，高达40%的这类肿瘤患者都携带具有遗传易感性的生殖系变异。

通过了解根本的遗传问题，我们就可以沿着肿瘤发展的道路前进，了解这一过程中的步骤。我们已经鉴定了一些可用于诊断和治疗内分泌疾病的靶点。

Q：NGS和其他技术如何为这些研究进展提供助力？

RCB：NGS发现的基因越来越多，这已经成为了一个高速发展的领域。在过去的五年中，RNA-Seq、DNA甲基化分析、CNV芯片等NGS技术以及质谱技术，推动了肿瘤生物学新时代的重大进展。我们觉得我们赶上了一股探索遗传性内分泌肿瘤的浪潮。这是一次疯狂的旅程，非常刺激。

“在过去的五年中，RNA-Seq、DNA甲基化分析、CNV芯片等NGS技术以及质谱技术，推动了肿瘤生物学新时代的重大进展。”

Q：你们使用NGS发现了哪些传统技术无法发现的结果？

RCB：NGS让我们能够通过多种方式发现变异。我们研究的疾病具有遗传异质性，因此我们需要对每个样本中的多个基因进行评估。这个耗时的过程增加了假阴性结果的可能性。使用NGS，我们能够在单次检测中同时对多个样本中的大量基因进行测序。

我们对于研究合子后嵌合能否引发某些内分泌肿瘤综合征中的基因失活也很感兴趣。为此，NGS的优势在于可以使用MiSeq系统和TruSeq Custom Amplicon Assay，实现600倍或更高倍数的超深度测序。

我们可以使用Kolling研究所收集的大量样本，这些样本涵盖了20–30年间来自受影响家庭的遗传性内分泌肿瘤样本。先前的技术方法通常无法告诉我们这些样本的基因的情况。通过使用NGS对该组织库的样本进行测序，我们正在持续不断地发现致病性变异。这太令人兴奋了。

Q：MiSeq系统如何为你们的研究提供支持？

RCB：我们正在使用TruSeq Custom Amplicon开发在MiSeq系统上使用的定制扩增子NGS panel，它包含20个或更多基因。快速高效的MiSeq系统能让我们进行超深度测序，这对于我们的研究至关重要。

我们有使用其他测序系统进行研究的经验，但MiSeq系统最适合我们的实验室。四年前获得它的时候，我们担心过它是否稳定以及潜在的污染问题，我们当时在寻找一种能从设计的角度上限制潜在的组织样本之间交叉污染的系统。我们认为MiSeq系统在这方面做得最好。

“TruSeq Custom Amplicon Assay效果很好，我们对测序化学技术、数据读取和生物信息学处理都很满意。”

Q：你们有用过DesignStudio软件来设计TruSeq Custom Amplicon panel吗？

RCB：在设计我们的定制扩增子panel时，DesignStudio非常简便易用，更重要的是，它运行良好且功能强大。它覆盖了我们目前研究的大部分基因。

Q：你们喜欢TruSeq Custom Amplicon Assay的哪方面？

RCB：TruSeq Custom Amplicon Assay效果很好，我们对测序化学技术、数据读取和生物信息学处理都很满意。创建定制扩增子检测是一个反复的过程，我们已经创建了各种定制设计，添加了新基因，有时会稍作调整。我们对于TruSeq Amplicon-Cancer panel的经验有限，主要是因为我们从自己的定制设计中获得了如此好的结果。TruSeq Amplicon-Cancer panel最近进行了升级，也许将来我们会使用该panel。

Q：你们在进行这项研究时遇到过哪些生物信息学方面的困难？

RCB：总体而言，MiSeq系统在捕捉相对容易获得的结果方面表现极佳。在扩增子测序中，新手常犯的错误是忘记了并不是每个样本的每个扩增子都能被均匀覆盖。为解决这个问题，我们的生物信息学处理程序纳入了一种算法，该算法可以让我们查看任何单个样本在每次运行中实际覆盖的区域。

我们仍在研究如何充分利用NGS和生物信息学处理程序来检测较大的缺失。我们已经能检测出长达26 bp的缺失，大概1%的病例具有较大的缺失（整个外显子或整个基因缺失）引起的基因失活。我们的生物信息学处理程序尚未达到检测大片段缺失的标准，对于这种检测，我们仍然依赖于多重连接依赖性探针扩增（MLPA）技术。

我们合作的一家机构最近购买了HiSeq X Ten系统，我们很想知道这台功能强大的仪器的基因组覆盖度，能否让我们可靠地检测大片段缺失。我们正在设计一个研究课题来探讨这个问题。

“快速高效的MiSeq系统能让我们进行超深度测序，这对于我们的研究至关重要。”

Q：你们用什么来进行生物信息学处理？

RCB：我们不是生物信息学实验室，所以我们选择的是简便易用的软件工具。我们现在使用MiSeq Reporter来进行比对和变异检出，然后再用Annovar注释变异。我们使用了一些内部算法，不过就我们的目的而言，MiSeq Reporter已经非常强大了。Integrative Genomics Viewer（IGV）也是一个用户友好型工具，我们利用它来对每个扩增子的数据进行可视化。

Q：你们一次测序多少个样本？

RCB：我们每次运行48–96个样本。我们每次运行的样本数量不会更低，否则就不划算了。我们比较谨慎，每个样本都很有可能包含致病性变异，因此我们必须客观地解读每个样本。考虑到我们的定制扩增子panel由20–30个基因组成，我们采用了超过1000倍的覆盖度对48–96个样本进行测序。我们的合作伙伴经常说我们这是在用牛刀杀鸡。但我们对覆盖深度的要求相当严苛，而它可以满足我们的需求。

Q：你们会使用MiSeq系统对FFPE样本进行测序吗？

RCB：我们已经在研究中成功地对FFPE DNA样本进行了测序。在对FFPE样本进行测序这方面，MiSeq系统非常有前景，它可在单次检测运行中很好地覆盖较大范围的基因。

Q：您的实验室用了多长时间来将MiSeq系统纳入工作流程？

RCB：我们从没有NGS相关经验开始，到可以熟练运行MiSeq系统只经过了2–3次测序运行。简便易用是MiSeq系统的优势，也是我们选择它的原因之一。我们喜欢它的测序化学技术，非常简单直接。

“MiSeq系统将一年的测序工作压缩到了一个星期。”

Q：使用MiSeq系统对扩增子panel进行测序的周转时间是多久？

RCB：制备文库和加载系统大约需要两天时间；测序、比对和变异检出大约需要27个小时（全部都在MiSeq系统上执行）。变异检出的注释可在1–2个小时内完成。解读已注释的产出数据通常大约需要一周的时间。

因此，借助MiSeq系统和我们的综合性panel来分析48–96个样本中的20个不同基因，大约需要10天的时间。我们进行过大量的桑格测序，该方法需要一年多的时间才能逐个测完这么多样本。MiSeq系统将一年的测序工作压缩到了一个星期。在科学界很少见到这种生产力上的飞跃。这非常惊人。

深入了解本文提及的Illumina产品和系统：

MiSeq系统，www.illumina.com/systems/miseq.html

TruSeq Custom Amplicon Assay, www.illumina.com/products/truseq_custom_amplicon.html

DesignStudio软件，www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/designstudio.html

TruSeq Amplicon-Cancer Panel, www.illumina.com/products/truseq_amplicon_cancer_panel.html

HiSeq X Ten系统，www.illumina.com/systems/hiseq-x-sequencing-system.html

MiSeq Reporter软件，www.illumina.com/systems/miseq/software/miseq-reporter.html

Integrative Genomics Viewer, www.illumina.com/informatics/research/sequencing-data-analysis-management/basespace/basespace-apps/integrative-genomics-viewer-1886885.html

参考文献

1. Genetics of Endocrine and Neuroendocrine Neoplasias—for health professionals (PDQ).National Cancer Institute.www.cancer.gov/types/thyroid/hp/medullary-thyroid-genetics-pdq.Accessed October 15, 2015.