NGS为生物标记的发现提供了宝贵信息

简介

基因组学已经改变了生物医学的所有领域，而DNA测序对癌症研究的影响最为深远。科学家们对肿瘤进行了深入研究，鉴定了那些看起来相同的癌症之间细微的和不那么细微的区别，进一步了解了肿瘤的病因，以及它们对不同治疗方法的反应。作为Georges-François Leclerc中心（CGFL）的实验室主任，Romain Boidot博士为数百名科学家和临床研究人员提供了测序资源。

自2012年以来，Boidot博士和CGFL一直借助Illumina的新一代测序（NGS）系统进行癌症研究。最初他们使用MiSeq系统来进行转录组测序（RNA-Seq）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq），还使用基因panel来鉴定实体瘤。2015年1月，为了获得更高的产量、进行更深度的测序，他们添置了NextSeq 500系统。他们目前开展的一个项目是对乳腺癌基因表达生物标记进行分类，以便有效地描述实体瘤，希望能有助于治疗和预后。

iCommunity采访了Boidot博士，深入了解了CGFL的癌症研究，以及使用MiSeq和NextSeq 500系统进行RNA-Seq、ChIP-Seq和外显子组测序如何帮助其研究人员发现癌症生物标记。

Q：CGFL正在进行哪些类型的基因标记研究？

Romain Boidot（RB）：我们研究癌细胞，也研究免疫细胞特有的基因。我们用RNA-Seq来检测哪些免疫细胞类型或T淋巴细胞亚型会浸润肿瘤。RNA-Seq的好处在于，我们既可以研究肿瘤细胞，又可以研究形成肿瘤微环境的细胞。我们正在开展一项包含30–40名癌症患者的新项目，其目的是鉴定与免疫治疗反应相关的具体标记。

Q：您如何将NGS整合到您实验室的研究中？

RB：首先，我们想用癌症基因panel来研究样本。我们是法国最早拥有MiSeq系统的机构之一。我们需要时间来熟悉系统，了解工作流程，并确定哪种文库制备技术最适合我们的研究。进行了六个月的DNA测序后，我们决定也尝试一下RNA-Seq。2013年初，我们开始在MiSeq系统上运行RNA-Seq。

Q：你们在MiSeq系统上进行了哪些类型的测序项目？

RB：最初，我们使用MiSeq系统以及一个包含BRCA和同源重组基因的癌症基因panel来进行常规的测序工作，以此来研究乳腺癌和卵巢癌的易感性。

Q：是什么促使您在2013年初转而使用RNA-Seq？

RB：首次使用RNA-Seq是在一个免疫学研究项目中，其中包括一项T-CD4淋巴细胞分化研究。¹最终我们有两个项目使用了MiSeq系统来进行RNA-Seq，并且都进行得非常顺利。我们购买了NextSeq 500系统，它能在每次运行中提供更高的通量、更多的read。

“我们购买了NextSeq 500系统，它能在每次运行中提供更高的通量、更多的read。”

Q：你们如今在NextSeq 500和MiSeq系统上进行什么类型的研究？

RB：MiSeq和NextSeq 500系统之间有协同作用。基本上，我们是根据序列区域的大小和样本的数量来做决策。我们在NextSeq 500系统上进行常规的外显子组研究，进行多学科分析、RNA-Seq和ChIP-Seq。我们也会将它与panel一起使用，尤其是在我们有一大群受试者时。我们会在NextSeq 500系统上运行大量的受试样本，而不是在MiSeq系统进行多次运行。

我们通常在MiSeq系统上进行panel的常规测序。我们起初使用癌症基因panel和小型癌症基因集，现在使用体细胞基因panel。

Q：NextSeq 500系统的优势是什么？

RB：主要的优势在于read深度。借助MiSeq系统，我们大约可以获得1200–1500万条read。NextSeq 500系统可以将read深度提高到4亿条read。

NextSeq 500系统可以进行大量的样本多重分析，获得比MiSeq系统更深的深度，因而能降低每次分析的成本。这让我们可以进行更多的RNA-Seq项目。更快获取结果也是它的一个显著优势。

Q：MiSeq和NextSeq 500系统的数据质量有什么不同吗？

RB：我们在两台仪器上都能获得高质量数据，我们非常满意。它们提供的数据质量足以支持我们的基础研究和转化研究。而在NextSeq 500系统上进行RNA-Seq，其read深度要深得多，能为我们提供更多信息。我们目前正在对MiSeq和NextSeq 500系统的癌症基因panel测序进行比较，应该很快就能得到结果。

“使用BaseSpace Onsite上的流程进行分析，无论是BWA还是Isaac，都能让我们在NextSeq 500系统上运行外显子组工作流程。”

Q：你们花了多长时间来将NextSeq 500系统投入常规使用？

RB：NextSeq 500系统的安装过程非常顺利。我们几乎立即就启用了。我们在NextSeq 500系统上进行的第一次测序是RNA-Seq，结果非常好。该系统在2015年1月送达，3月中旬开始运行，2015年6月我们就开始常规运行RNA-Seq了。随后我们开始在该系统上进行ChIP-Seq和外显子组测序。

在学习如何操作这个系统时，我们大部分的时间都花在了文库制备上。我们发现，通过调整浓度，我们可以获得最佳的簇数量，并且能充分利用其测序能力。

我们还得学习了如何设置软件的测序运行。我们使用包含Prep Tab软件的BaseSpace Onsite Server*来帮助我们安排测序运行的混合文库。

Q：BaseSpace Onsite对你们的测序流程有什么影响？

RB：我们需要向CGFL的研究人员展示，我们了解并且有能力进行测序，使用我们的实验室会给他们带来真正的附加价值。使用BaseSpace Onsite上的流程进行分析，无论是Burrows-Wheeler Aligner（BWA）还是Isaac比对软件，都能让我们在NextSeq 500系统上运行外显子组工作流程。如果我们没有BaseSpace Onsite，我不认为我们能像现在一样快速地运行外显子组工作流程并且达到同样的质量。

Q：由单个供应商提供全面的工作流程能带来什么好处？

RB：与单个供应商合作可以为我们提供单点联系来协助我们解决问题。全面的工作流程为我们提供了分析连续性。它能让我们的整个过程更加顺畅，并获得高质量的结果。

“我们现在在NextSeq 500系统上运行所有的临床研究样本……因为它能让我们以所需的外显子组大小来进行多个样本的外显子组和panel测序。”

Q：NextSeq 500系统在临床研究中有什么价值？

RB：我们现在在NextSeq 500系统上运行所有的临床研究样本。我们选择这个系统是因为它能让我们以所需的外显子组大小来进行多个样本的外显子组和panel测序。我们临床癌症研究的重点是在受试者同意的情况下研究应用性生物标记，以此来寻找文献中尚未发现的生物标记。

Q：Illumina的客户支持是否能提供帮助？

RB：Illumina的客户支持非常出色。出现问题时我们会向他们寻求支持，这些问题都能迅速解决。

Q：NGS是否改变了你们在研究中使用的癌症基因panel的类型？

RB：NGS为我们提供了非常强大且先进的研究工具，能帮助我们提高研究的影响力。我们使用桑格测序对BRCA1和BRCA2 panel进行了测序。而利用NGS，我们对由BRCA1、BRCA2和超过23个其他基因组成的panel进行了测序，这些基因均被认为与乳腺癌和消化系统癌症的易感性相关。通过使用这些panel，我们发现，那些过去只作为乳腺癌和卵巢癌易感性研究对象的基因或许对消化系统癌症的易感性也有影响，反之亦然。

Q：你们研究的下一步计划是怎样的？

RB：我们下一步还会继续进行外显子组测序，会继续鉴定新的针对靶向免疫疗法和常规化疗的反应性生物标记。我们还想要开发能够分析循环DNA变异的panel。NextSeq 500系统提供了更高的read深度，能帮助我们确定信息阈值，它能让这些研究成为可能。将来我们还会使用RNA-Seq来研究石蜡包埋肿瘤组织中的融合基因和变异。

Q：您以前有想过通过NGS可以实现这些进展吗？

RB：在撰写论文时，桑格测序是我们当时唯一能使用的技术。当我回到CGFL开始我为期两年的实习时，我都还没有改变这种看法。之后我参加了一个跨部门的会议，我听到别人在谈论Illumina NGS系统开始出现的情况。当我们看到第一批送往欧洲的MiSeq系统时，我们意识到它们可以增加研究的价值。我从未想象过我们可以用MiSeq系统以及现在的NextSeq 500系统做这么多事情。