2025年2月25日
自 2012年发现CRISPR-Cas9基因编辑技术以来，研究人员一直热衷于探索其治疗人类疾病的潜力。CRISPR-Cas9首次提供了一种精确、靶向的基因修饰方法：研究人员在CRISPR-Cas9系统的CRISPR部分中设计了特定的RNA片段，通过序列互补性靶向目标基因。靶向RNA或向导RNA将整个机制引导至DNA的特定区域，在此，Cas9核酸酶如剪刀一样切割DNA。当细胞的自然修复通路启动，目标基因则被有效地编辑。
Perturb-seq是CRISPR-Cas9技术的演变，该技术利用其基因靶向能力选择性地激活或灭活目标基因的表达。该技术与单细胞全转录组基因表达分析相结合，研究CRISPR-Cas9介导的基因激活或失活对全转录组的影响。
现在，因美纳科学家开发了一种高通量方法，让研究人员可以在CRISPR-Cas9干扰基因后，分析单个细胞的全转录组。这些方法将于2025年2月在佛罗里达州举行的 基因组生物学和技术进展（AGBT） 大会上展示。
因美纳产品开发高级总监Kristina Fontanez表示：“因美纳的方法尤为重要，因为它使研究人员能够高效地研究CRISPR-Cas9介导的基因表达干扰后基因型和表型之间的相互作用，帮助他们以全新的规模了解特定通路。”她还是Fluent BioSciences的联合创始人，这是一家总部位于马萨诸塞州的生物技术公司，专注于单细胞分析的高通量工具，去年被因美纳收购。
以前，为了了解单基因敲除对表型的影响，研究人员不得不投入数年时间开发小鼠模型并进行后续研究。因美纳的副首席科学家兼Fluent BioSciences的联合创始人Robert Meltzer解释道，现在借助因美纳可扩展的CRISPR筛选方法，“你[拥有]统计能力来评估每次敲除一个基因，逐个细胞敲除每个基因的影响。”您可以在不同的组织类型、物种和生物体中执行此操作。这种技术是研究人员五到十年来梦寐以求的，而现在，您具备的样本制备、测序和分析能力已经可以使其成为常规操作。”
研究人员一直致力于开发可扩展的方法，用于分析组合CRISPR筛选的基因组和转录组。Meltzer的研究表明，传统方法只能处理约10,000个细胞批次。这足以在单个实验中评估数百个单独的CRISPR向导或干扰。“因美纳即将推出的100万个细胞反应规模将能够以出色的统计能力对10,000个向导RNA筛选进行常规处理。”他解释道，“结合因美纳的高容量NovaSeq™ X测序仪和试剂以及DRAGEN加速分析，全基因组CRISPR筛选不仅可行，而且实用且常规。”
成功实现大规模扩展依赖于被称为“粒子模板即时分区”或PIP的聚合物。PIP最初由加州大学旧金山分校的物理学家Adam Abate开发。它们是水凝胶颗粒，有助于乳化混合物，并在涡旋过程中自发地分离细胞，形成数十万甚至数百万个均匀的液滴，然后进行转录组测序。Fluent BioSciences将PIP开发为可大规模扩展的单细胞技术，以便通过新一代测序读数进行基因表达图谱分析。基础的Fluent PIPseq技术现在称为 Illumina Single Cell 3' RNA Prep。Fontanez说：“这确实改变了单细胞技术的可及性。”
为了获得CRISPR-Cas9干扰细胞的单细胞分辨率，Fontanez和同事修改了PIP，以识别CRISPR向导RNA骨架和mRNA。通过这种方式，当单个细胞被捕获到单个液滴内时，PIP能够识别细胞内存在的特定向导RNA，以及细胞转录组对CRISPR-Cas9介导的基因干扰的响应。
PIP帮助解决了为单细胞分析制备高通量样本的问题，而Illumina NovaSeq™ X可以高效地分析这些细胞中受到CRISPR-Cas9干扰的转录组。因美纳的分析工具DRAGEN具有独特的功能来分析这些数据集，这一过程可能计算量非常大。
Fontanez和Meltzer对于扩大该检测的规模很感兴趣。但在短期内，他们更热衷于将这项技术推广给其他人。Meltzer表示：“我们可以开发的应用数不胜数，但目标是尽快将其交付给客户。” ◆
