靶向多基因测序panel让发现变异 更加快速且经济高效

简介

Franco Taroni，医学博士，米兰卡罗贝斯塔神经科学研究所（INCB）神经退行性和代谢疾病遗传学机构的负责人，他的团队在该研究所主攻代谢和神经障碍。25年来，他们使用桑格测序进行研究，以确定罕见的神经退行性疾病，如小脑共济失调、痉挛性截瘫和遗传性神经病变的分子基础。三年前，他的团队从桑格测序转向使用MiSeq系统靶向新一代测序（NGS），开发了一套独特的实验流程，使用不同的靶向多基因panel，以确定与这些神经退行性疾病相关的潜在遗传变异。

NGS帮助Taroni博士的小组识别变异，仅需花费原时间的一小部分，且成本较桑格测序显著降低。2016年，该团队发现了导致进行性神经性腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease）的新突变，该疾病是一种影响外周神经的遗传性神经障碍。^1-3他们还对患有小脑共济失调的受试者进行筛选，以确定巨基因SYNE1中的突变。⁴Taroni博士的团队发表有多篇论文，阐述了与脑白质病变和周围神经病变相关的新变异的发现过程。

iCommunity与Taroni博士就他在研究中使用的靶向多基因测序panel进行了对话，并探讨了MiSeq系统如何拓展和加快他的研究工作。

Franco Taroni，医学博士，意大利米兰卡罗贝斯塔神经科学研究所（INCB）神经退行性和代谢疾病遗传学机构的负责人。

Q：神经和代谢疾病的哪些方面最先吸引了您？

Franco Taroni（FT）：我曾在医学院接受过神经科医师的训练。20世纪80年代初当我开始在实验室工作时，我专注于神经和代谢疾病的生化和代谢方面的研究。解决这些疾病所面临的困难问题，是一个激动人心的挑战。

Q：卡罗贝斯塔神经学研究所有着怎样的使命？

FT：研究所的研究重点是儿童和成人的神经和代谢紊乱。我们看到一些罕见遗传疾病的例子，我们尝试通过测序来破译新型变异。

Q：您团队的研究重点是什么？

FT：我们的团队长期关注和研究脊髓小脑共济失调，这是小脑及其传入和传出路径的一种疾病，从而导致运动障碍。这类疾病与帕金森病有所不同，因为除了震颤之外，患者还缺乏动作的协调性。

我们还专注于痉挛性截瘫，这是一种皮质脊髓运动神经元路径疾病，以及外周神经和髓鞘疾病，这些疾病会影响中枢神经系统的髓鞘形成。异质性遗传病因是神经系统疾病的特征，通常每个症状与超过50个基因有关。例如，对于一位我们怀疑其患有遗传性疾病的小脑功能障碍受试者，可能有超过80种不同的遗传基因导致该病症。

Q：您的实验室使用桑格测序有多久了？

FT：我们从1989年开始使用桑格测序，三年前我们购买了MiSeq系统后转向使用NGS。

Q：是什么因素促使您从桑格测序过渡到NGS？

FT：神经和代谢疾病的异质性让我们考虑在研究中使用NGS。多达90–100个基因可能会对我们正在研究的疾病的表型有影响。使用桑格测序，我们一次只能检测7-12个基因。如果使用桑格测序分析80个基因的话，成本将是我们难以承受的。

NGS方法使我们能够同时分析多个基因并且极具成本效益，帮助我们了解这些疾病的复杂性。现在我们使用桑格测序，对通过NGS识别的变异进行验证。

"使用NGS，对一个样本分析200个基因需要大约两天的时间。如果使用桑格测序，可能需要花费几个月才能完成同样的分析。"

Q：您为什么选择靶向多基因panel检测，而不是全基因组或外显子组研究？

FT：作为首选方法，全基因组测序（WGS）研究对我们而言过于昂贵，并且在生物信息学分析方面非常复杂。我们优先选择几乎100%覆盖感兴趣基因的panel，是因为额外花更多钱做全外显子组测序（WES）并不值得的。我们为不同疾病（包括共济失调和痉挛性截瘫、神经病、中枢髓鞘失调引起的脑白质病变、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、癫痫）创建五个靶向测序panel。除了成本较低之外，靶向多基因panel检测可消除偶然发现的复杂问题。

Q：为了识别与神经性疾病和代谢疾病有关的变异，您采用的基于NGS的靶向测序是怎样的实验流程？

FT：我们的NGS实验流程基于MiSeq系统，每次运行可以处理12到24个样本。我们开始时使用廉价的、小型预筛选panel，并在必要时转向更大的靶向多基因panel。基于靶向的基因数量，我们使用Nextera® XT DNA或Nextera Rapid Capture Custom Enrichment Library Prep，制备多基因panel测序文库。

首先，我们筛选出一些与受试者呈现的疾病有关的最常见突变基因。通过靶向筛选，我们可捕获25–35%的致病变异。根据我们想要分析的疾病或表型的不同，其基因组合也是不同的。例如，共济失调患者通常有4–6个常见基因，这些是我们首先筛选的基因。对于这些小范围的靶向多基因panel，我们使用Nextera XT DNA Library Prep Kit，制备样本并构建扩增子文库。

如果这些基因的筛选结果为阴性，我们将增加筛选范围，利用多基因panel进行第二轮靶向测序。每个panel几乎都包括与特定疾病相关的所有基因（每个panel含有70–200个基因）。例如，用于共济失调的panel中包含了可导致以共济失调为主要症状的所有已知基因。脑白质病变的panel中包含了可导致中枢神经系统髓鞘脱失的所有基因，等等。对于这些大范围的靶向多基因panel，我们使用Nextera Rapid Capture Custom Enrichment Kit。该试剂盒非常好用，特别是在受试者呈现的表型连续性涉及多个基因时。例如，共济失调的患者也可能表现出痉挛性截瘫，而表现痉挛性截瘫的患者可能患有共济失调。用一个panel测试多个疾病相关的基因，比用两个独立的panel进行检测有优势。通过Nextera Rapid Capture Custom Enrichment，我们还可以分析拷贝数变异，使我们能够确定可能导致疾病的缺失或重复。

如果使用疾病panel没有找到疾病相关的变异，我们将转向外显子组测序，更大范围去确定感兴趣的变异。

"基于目标基因的数量，我们使用Nextera XT DNA或Nextera Rapid Capture Custom Enrichment Library Prep Kit制备多基因panel的测序文库。"

Q：您如何将新基因纳入您的panel中？

FT：我们的panel会定期重新设计。每次重新定购时，我们将有机会添加我们或其他人在该研究中确定的新基因。尽管Nextera Rapid Capture Custom Enrichment Kit允许多个基因，但我们有时候仍然需要拿掉一些基因来为新的基因腾出空间。

Q：您为什么选择MiSeq系统来开展您的靶向重测序研究？

FT：我们选择MiSeq系统是基于自身预算的考虑，以及数据质量的可靠性，尤其是在长重复碱基的情况下。系统运行速度快和应用广泛也是我们的考虑因素之一。

Q：您如何分析数据？

FT：数据分析从VariantStudio软件开始。随后数据将进行下游分析，其中包括一些公共可用的商业软件，如CLC Genomics Workbench和Database。我们使用Database过滤变异，同时也使用其他工具，包括EVS、HGMB、ExAC和1000 Genome。

我们建立了自己的本地数据库，用于研究意大利人群中发现的变异。公开可用的数据库多是基于北美或盎格鲁撒克逊人的基因型。我们的数据库有效解决了意大利多态性分布的变异性，对生物信息学分析非常重要。

我们还使用一些生物信息学工具，对变异体的功能进行预测，例如，利用Sorting Intolerant from Tolerant（SIFT）和Polymorphism Phenotyping（PolyPhen）预测氨基酸替换，NNSplice和Alternative Splice Site Predictor（ASSP）预测RNA剪接的剪接位点。通常情况下，我们需要通过体外实验测定蛋白质和RNA水平，从而验证计算机预测的功能。尽管我们尝试通过实验来验证变异体，但这种方法并不总是可行。对于我们正在评估的特定基因，通常没有功能性分析方法。

Q：与桑格测序识别变异相比，在MiSeq系统上基于NGS的靶向多基因panel在产出和周转时间方面，效果如何？

FT：在分析的基因数量，以及分析报告的全面性方面，NGS优于桑格测序。在桑格测序时代，我们一次只能对一个基因进行测序，并且只能为该特定基因的特定测序部分生成报告。周转时间相当长，我们只能对有限数量的基因进行测序。

使用NGS，对一个样本分析200个基因需要大约两天的时间。如果使用桑格测序，可能需要花费几个月才能完成同样的分析。

"我们已经使用MiSeq系统的靶向测序流程，快速识别了新的基因和表型。"

Q：您使用这一流程发现了哪些基因？

FT：我们已经使用MiSeq系统的靶向测序流程，快速识别了新的基因和表型。我们设计了包容性尽可能强的panel，甚至包括了引起特定表型的不常见基因。有时我们会遇到意想不到的结果，例如某个基因中的某种突变，它通常的表型与样本出现的表型不一致。对于这些样本，我们发现了已知基因的新表型。

有两个样本，我们使用外显子组测序确定了新的基因。这两个样本来自髓鞘病症受试者，经初步筛查和靶向多基因panel测序，检测结果呈阴性。这两种突变相对罕见。我们正在完成对这两种基因的研究，这项工作尚未发表。找到与表型相关的新基因总是很有趣。

我们还在准备两篇论文，以报告感兴趣病例的结果，其中用脑白质病变和外周神经病变panel鉴定了多个突变。对于具有罕见疾病的受试者，不知道疾病成因会令人非常沮丧。因此，提高我们的潜在分析能力是非常重要的。

Q：您的实验室如何看待从桑格测序到NGS的过渡？

FT：从桑格测序转向NGS是一项非常重大的转变。NGS更加复杂，并不是每个人都能以完全自主的方式使用这项新技术。我们团队中只有少数几个人有能力制备Nextera Rapid Capture文库或者对结果进行分析，但大多数人都能够构建Nextera XT文库并完成测序实验。它改变了我们实验室的文化，以及大家对该系统可能性的看法。

Q：您研究的下一步计划是怎样的？

FT：我们想与临床医生合作，从患者、家人和其他亲戚那里获取样本，并建立一个测序结果的数据库。这将对我们的研究产生重大的影响。这将使我们能够针对意大利人群，建立一个具有正常和病理变异详细信息的数据库，从而提高测序项目的筛查能力。这不是我们仅凭自身就能做到的事情，因为我们不直接接触病人。

我们刚刚加入一个名为“Beyond the Exome”的欧洲计划。该计划的范围是集合不同的研究方法（RNA测序/转录组学，蛋白质组学和WGS），将其应用到已经过外显子组测序但仍然未解决的病例中。我们将把我们的测序研究扩展到单细胞上，并进行功能分析。我们非常期待在NextSeq®500系统上开展RNA-Seq实验。